細胞周期與骨髓增生異常綜合征化療療效的前瞻性分析

詹 揚 王麗紅 鐘 龍 陸 佳 徐海濤 楊達天 陳丹桂 陳 非

骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組異質性疾病，其基本病變為克隆性造血干細胞發育異常，導致無效造血，有向急性髓系白血?。ˋML）轉化的高風險。DNA甲基化異常是MDS最常見的表觀遺傳學改變，DNA甲基化可調控細胞周期和凋亡相關基因的表達。抑制 DNA異常甲基化可顯著改善部分 MDS 患者的病情，延長其生存期，改善生存質量，使更多患者獲益?，F今治療MDS的去甲基化藥物（HMAs）有阿扎胞苷和地西他濱。地西他濱是核苷-脫氧胞苷類似物，可在細胞中與DNA甲基轉移酶共價結合，使DNA甲基轉移酶失活，減少基因組DNA的甲基化水平，促進抑癌基因功能恢復，從而改善MDS患者輸血依賴。地西他濱自2006年首次被FDA批準使用后，現已成為國內外中高危MDS的一線治療藥物。地西他濱雖然總體上改善了生存率，但反應率低，且難以達到持續緩解和長期益處，特別是在治療過程中疾病復發或喪失原有的療效后，患者預后都不良。因此臨床上急需預測地西他濱去甲基化治療療效的可靠指標，預測治療療效極為重要，可以調整個體化的挽救性治療。本研究旨在利用流式細胞術分析中高危MDS患者在接受地西他濱治療之前的細胞周期，結合患者療效評估此類患者的化療效果，以期發現細胞周期與化療療效的內在聯系，能夠對中高危MDS患者進行更加針對性的化療，從而提高中高危MDS患者的化療效果，提升其預后生存。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集本院2019年11月-2021年4月收治的中高危MDS患者病例數50例，篩選其中27例，男16例，女11例，平均年齡（64±12.49）歲。所有患者的診斷均根據維也納最低診斷標準，并根據FAB分型標準進行分型。本研究經安徽醫科大學安慶醫院倫理委員會批準，外周血樣本的取得均經患者知情并簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標準 ①納入標準：經過骨髓穿刺、染色體核型及外周血檢查等確診MDS且根據IPSS-R（International PrognosticScoring System-R）評分為中高危；臨床資料完整；沒有其他造血相關疾??；納入患者均以地西他濱為主方案治療。②排除標準：對治療藥物過敏；治療前有嚴重感染的患者；治療前存在嚴重的心、腦、肝、腎等重大器官障礙；患有其它重大疾??；存在嚴重意識障礙或溝通障礙。

1.3 流式細胞術檢測患者外周血細胞周期 收集患者進行化療前3～5天的外周血2 mL，外周血進行離心后吸取上清，加入PBS，混勻，離心，吸取上清，留管1 mL，對細胞進行計數。向試管中加入紅細胞裂解液，混勻，在室溫避光孵育后立即離心。棄上清，加 PBS 重懸，低速混勻，室溫離心。根據試劑盒（C1052，碧云天）廠家說明書對細胞染色，將樣本避光保存于2 ℃～8 ℃冰箱，3 h內上機（Attune NxT，Thermo），上機時用手敲管底輕輕混勻。

1.4 治療方案 患者均注射地西他濱（國藥準字號：H20120067）進行治療，使用劑量為20 mg·m·d，采用靜脈滴注方式進行。用藥的時間為開始治療的第1～5天，4周為1個療程，均治療了4療程。在治療過程中如有嚴重的感染及骨髓抑制時，根據實際情況適當延長了治療間隔時間。患者在治療過程中如有嘔吐、感染等癥狀均進行相應的治療。

1.5 觀察指標 根據IWG（International Working Group）制定的療效標準對地西他濱治療后的效果進行判斷評估。療效標準包括完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、骨髓緩解（mCR）、血液學改善（HI）、疾病穩定（SD）、疾病進展（PD）等。

1.6 統計學分析 采用GraphPad 9.0軟件系統處理數據，計量資料進行t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床化療療效分析 對27例患者進行了地西他濱治療6個月后，其中17例病情穩定（SD），10例病情惡化（PD），見表1。

表1 患者臨床資料及化療療效分析

2.2 化療療效與細胞周期的關系 根據臨床的化療療效將患者分為化療后病情穩定SD和化療后病情惡化PD兩組，對這兩組患者在化療前3～5天的細胞周期進行分析（表2），結果發現病情穩定SD組和病情惡化PD組的G0/G1期差異無統計學意義（P＞0.05）；在S期，病情穩定SD組與病情惡化PD組差異無統計學意義（P＞0.05）；在G2/M期，病情穩定SD組與病情惡化PD組差異無統計學意義（P＞0.05）。以上結果說明化療療效與化療之前的細胞周期（G0/G1、S、G2/M）均無關聯性（P＞0.05）。

表2 地西他濱化療療效與細胞周期的關聯性分析

3 討 論

MDS的特點是髓系細胞分化或發育異常，臨床表現為難治的一系或者多系細胞減少的血液病，多發于老年人。目前，臨床上治療MDS可通過造血干細胞移植來進行治療，但受其它各方面因素影響，該療法在臨床上的應用不多。臨床上多采用去甲基化藥物HMAs（阿扎胞苷和地西他濱）對MDS進行化療治療。地西他濱進入腫瘤細胞后，在脫氧胞苷激酶的作用下被磷酸化成具有活性的物質，之后與DNA甲基轉移酶結合從而對甲基轉移酶的活性進行抑制，促使DNA去甲基化，達到有效治療MDS的目的。雖然地西他濱的治療已被證明可以延長生存期，但只有40%～60%的患者對治療有反應，反應幾乎普遍是短暫的，在2年內失去反應。一旦對這些藥物失去反應，預后就很差。地西他濱在臨床上有雙重的治療效果，低濃度的地西他濱能通過去甲基化對表達抑制的基因進行激活，有助于細胞分化；而高濃度的地西他濱則對細胞有胞毒作用。因此在臨床上對地西他濱的化療療效進行預測，以提升治療效果，減少不良反應就顯得至關重要。同時為是否需要提前考慮HMA聯用化療、BCL-2抑制劑等靶向藥物、免疫治療以及細胞治療等方案提高患者化療療效提供依據。

地西他濱作為S期細胞周期特異性藥物，在多種疾病中均能通過阻斷細胞周期S期和G2期抑制腫瘤細胞的增殖。研究發現細胞周期調節在化療藥物治療的機制中發揮重要作用，并在一定程度上影響著化療療效。在晚期食管癌中，通過流式細胞術分析食管癌細胞周期與化療療效之間有一定的關聯性，并且高S期的腫瘤對化療藥物更為敏感，為食管癌化療療效提供新的預測指標。本研究重點在于通過流式細胞術分析患者在采用地西他濱治療之前細胞周期，為研究和預測地西他濱化療的療效提供依據。本研究中在地西他濱治療之后根據IWG療效評分將患者分為病情穩定SD和病情惡化PD組，發現這兩組患者在化療之前細胞周期的G0/G1、S、G2/M期均沒有顯著性差異（P＞0.05），說明細胞周期與地西他濱治療MDS化療效果之間沒有顯著性的差異。

本研究中通過流式細胞術分析化療之前細胞周期用來追蹤化療療效評價，結果說明細胞周期與化療療效之間顯著性差異并不顯著。由于我們納入研究的患者只有27例，樣本量較小，所以有一定的局限性，隨著后續研究深入，納入研究樣本量的增加，可能會有其它的發現。據報道，地西他濱在體外能將MDS-L細胞阻滯在G0/G1期，阻止G0/G1細胞向S期細胞轉化。同時，地西他濱能抑制白血病細胞K562的增殖，抑制細胞周期蛋白CDK2、cyclin E1的表達，促進凋亡。在本研究中我們檢測的是地西他濱化療之前的細胞周期，后期的研究中，我們可以增加檢測地西他濱治療之后的細胞周期，通過觀察治療前后的細胞周期的變化，綜合患者預后情況，以期將細胞周期作為MDS療效評估以及預后的指標。MDS中甲基化異常，而DNA甲基化與細胞周期有密切關系。細胞周期受多種因子調控，這些因子相互關聯、相互制約。大多數化療藥物可以影響復制周期中的腫瘤細胞。因此，細胞周期調節劑聯合化療藥物是一種具有巨大應用潛力的抗腫瘤策略。有研究使用去甲基斑蝥素（DMC）抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A），從而加速細胞分裂以提高FCDDP的治療效果。因此在后續研究中我們可以根據細胞周期的差異變化來觀察化療藥物的療效，可能在化療過程中使用細胞周期抑制劑阻斷細胞，降低耐藥的影響，提高化療藥物的療效，為MDS的個性化治療提供依據。