FoxO1在同型半胱氨酸誘導的腎臟足細胞損傷及凋亡中的作用研究

張宏紅，謝琳，盛思琪，盧冠軍，姜怡鄧，楊安寧，李桂忠△

臨床上由代謝性疾病引起的腎損傷較為常見。同型半胱氨酸（Hcy）系含巰基的氨基酸，參與甲硫氨酸循環［1］。研究發現Hcy可損傷血管內皮細胞，影響其修復功能，進而導致血管內皮脂質代謝紊亂［2］。Hcy代謝異常可誘導腎功能受損，導致血肌酐升高，出現蛋白尿［3］。足細胞位于腎小囊的最內層，可高度特化并最終形成腎小球的臟層上皮細胞，進而構成腎單位濾過膜的外層，維持濾過屏障的正常功能［4］。足細胞結構或功能異常（如足細胞融合、足細胞間隔損傷等）被認為是腎功能損傷的關鍵因素［5］。此外，細胞凋亡是足細胞受損的形式之一［6］。叉頭狀轉錄因子（FoxO）蛋白家族在調節細胞新陳代謝和調控細胞周期等方面具有重要作用，其中FoxO1是研究最廣泛的亞型［7］。FoxO1可以通過調控細胞凋亡參與多種疾病的發生發展［8］。然而，FoxO1在腎損傷和足細胞凋亡中的作用機制尚不明了。本文旨在探討FoxO1在Hcy誘導的足細胞損傷和凋亡中的作用，為研究Hcy在腎臟損傷中的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 小鼠腎小球足細胞（MPC-5）購自上海瑞鹿生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司；Hcy購自美國Sigma公司；胰蛋白酶消化液購自上海碧云天公司；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白提取試劑盒購自南京凱基公司；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒、反轉錄試劑盒購自日本Takara公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根公司；兔源足細胞裂隙膜蛋白（Podocin和Nephrin）、FoxO1、半胱氨酸蛋白酶12（Caspase12）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）一抗均購自英國Abcam公司，鼠源內參蛋白β-actin一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司；PAS染色試劑盒、蘇木素染液購自北京Solarbio公司；FoxO1和GAPDH引物由上海生工公司合成；qPCR儀購自德國耶拿公司；電泳儀、電轉儀、凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad公司；CO2培養箱購自德國Heraeus公司。

1.2實驗動物和分組 4周齡，體質量18～22 g的胱硫醚β-合成酶（Cbs）基因正常Cbs+/+小鼠（Cbs+/+組）和單基因敲除Cbs+/-小鼠（Cbs+/-組）各10只，購自美國Jackson實驗室［實驗動物合格證號：SCXK（京）2016-0006］，于寧夏醫科大學實驗動物中心飼養。20只小鼠均在濕度為60%左右，溫度（25±2）℃，光照與黑暗各12 h交替的SPF級環境內分籠飼養，以2%高蛋氨酸飲食喂養8周后進行后續實驗。

1.3PAS染色檢測腎小球形態學變化 喂養8周后處死小鼠，取腎臟組織，石蠟包埋切片后脫蠟、脫水，蒸餾水洗2min；滴加過碘酸溶液，氧化5 min；自來水洗3次，每次5 min；滴加Schiff試劑，浸染10～20 min；棄去Schiff試劑，自來水沖洗3次，每次5 min；滴加蘇木素染色液，染核1～2 min；自來水沖洗3次，每次5 min；酸性乙醇分化液分化；Scott反藍液洗3 min；常規透明、封片，顯微鏡下觀察切片。

1.4細胞培養和分組 在37℃、5%CO2的培養箱中以DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清）培養腎小球足細胞。當細胞密度達到80%～90%時用胰蛋白酶消化進行傳代，傳至第3代時取對數生長期細胞進行實驗并分為Control組（僅更換培養液）和Hcy組（用含80μmol∕L Hcy的細胞培養液干預48 h）。

1.5細胞轉染及分組 將攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的過表達FoxO1腺病毒（Ad-FoxO1）和干擾FoxO1腺病毒（Sh-FoxO1）分別轉入生長狀態良好的腎小球足細胞中，分為對照組（僅更換培養液）、Ad-GFP組（過表達對照組）、Ad-FoxO1組（過表達FoxO1組）、Sh-NC組（干擾對照組）、Sh-FoxO1組（干擾FoxO1組）、Ad-GFP+Hcy組、Ad-FoxO1+Hcy組、Sh-NC+Hcy組、Sh-FoxO1+Hcy組。轉染6 h后更換液體，24 h后在熒光倒置顯微鏡下檢測各組細胞熒光強度，驗證轉染效率，轉染成功后用于后續實驗。

1.6Western blot檢測Podocin、Nephrin、FoxO1及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase12蛋白表達 收集各組細胞，提取總蛋白，BCA蛋白定量后煮沸變性。每組取30μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后以0.3 A恒流轉膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗膜3次，每次10 min。分別加入兔源Bax、FoxO1、Bcl-2、Podocin、Caspase12、Nephrin一抗以及鼠源β-actin一抗（稀釋比均為1∶1 000），4℃孵育12 h；使用辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min；ECL化學發光試劑顯影曝光。應用Image Lab軟件對檢測結果的灰度值進行分析，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達水平。

1.7qPCR檢測小鼠腎組織和足細胞中FoxO1 mRNA的表達 提取腎臟組織和足細胞總RNA，反轉錄為cDNA，采用qPCR擴增FoxO1及GAPDH。反應體系為20μL，擴增程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，70℃10 s，共40個循環，以GADPH為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.8統計學方法 采用Graph Pad Prism 7.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠腎小球損傷情況 PAS染色觀察小鼠腎小球形態變化，可見Cbs+/+組小鼠腎小球結構正常，基底膜清晰且分布均勻，而Cbs+/-組小鼠腎小球基底膜呈現節段性增厚，系膜基質增多。見圖1。

Fig.1 Representative PAS staining results of each mouse group(×400)圖1 PAS染色觀察小鼠腎小球損傷情況（×400）

2.2 小鼠腎組織中Podocin、Nephrin和FoxO1的表達水平 Western blot結果顯示，與Cbs+/+組小鼠相比，Cbs+/-組小鼠腎組織中Podocin蛋白（0.72±0.11vs.1.23±0.07，t=9.787，n=6）和Nephrin蛋白（0.54±0.08vs.1.14±0.16，t=8.259，n=6）表達水平均顯著降低（P＜0.01）；qPCR和Western blot結果顯示，與Cbs+/+組相比，Cbs+/-組 小 鼠 腎 組 織 中FoxO1 mRNA（1.75±0.20vs.2.69±0.50，t=4.304，n=6）和FoxO1蛋白（0.38±0.09vs.0.94±0.20，t=6.289，n=6）表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖2。

Fig.2 The protein expression levels of Podocin，Nephrin and FoxO1 in the kidney tissues of each mouse group圖2 Western blot檢測各組小鼠腎組織中Podocin、Nephrin和FoxO1的蛋白表達水平

2.3 Hcy對足細胞中FoxO1表達的影響 qPCR和Western blot結果顯示，與Control組比較，Hcy組FoxO1 mRNA（0.18±0.08vs.0.83±0.04，t=12.810，n=3）和FoxO1蛋白（0.40±0.02vs.0.78±0.04，t=14.450，n=3）表達水平均顯著降低（P＜0.01），見圖3。

Fig.3 The effect of Hcy on FoxO1 protein expression in podocytes detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測Hcy對足細胞中FoxO1蛋白表達的影響

2.4 過表達和干擾FoxO1后足細胞中FoxO1表達情況 Western blot結果顯示，對照組、Ad-GFP組、Ad-FoxO1組FoxO1蛋白表達量分別為0.14±0.04、0.13±0.01和1.09±0.16，與Ad-GFP組相比，Ad-FoxO1組FoxO1蛋白表達水平顯著增加（F=105.200，n=3，P＜0.01），見圖4。對照組、Sh-NC組和Sh-FoxO1組FoxO1蛋白表達量分別為0.87±0.12、0.83±0.09和0.35±0.02，與Sh-NC組相比，Sh-FoxO1組FoxO1蛋白表達水平顯著減少（F=35.210，n=3，P＜0.01），見圖5。

2.5 過表達FoxO1對足細胞中Podocin、Nephrin及凋亡相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與Ad-GFP+Hcy組相比，Ad-FoxO1+Hcy組中Podocin和Nephrin蛋白表達均明顯升高，Bax∕Bcl-2比值、Caspase12蛋白表達均明顯降低（P＜0.05），見圖6、表2。

Fig.4 The protein expression levels of FoxO1 in podocytes after overexpressed FoxO1 detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測過表達FoxO1后足細胞中FoxO1表達情況

Fig.5 The protein expression levels of FoxO1 in podocytes after restrained FoxO1 detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測抑制FoxO1后足細胞中FoxO1表達情況

Fig.6 The effect of overexpressed FoxO1 on the protein expression levels of Podocin，Nephrin and apoptosis-related protein in podocytes detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測過表達FoxO1對足細胞中Podocin、Nephrin及凋亡相關蛋白表達的影響

Tab.2 Changes of Podocin，Nephrin and apoptosisrelated protein expression in podocytes after overexpressed FoxO1 in the four groups表2 過表達FoxO1后各組足細胞中Podocin、Nephrin及凋亡相關蛋白的表達變化 （n=3，±s）

Tab.2 Changes of Podocin，Nephrin and apoptosisrelated protein expression in podocytes after overexpressed FoxO1 in the four groups表2 過表達FoxO1后各組足細胞中Podocin、Nephrin及凋亡相關蛋白的表達變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Hcy組比較，c與Ad-GFP+Hcy組比較，P＜0.05。

組別對照組Hcy組Ad-GFP+Hcy組Ad-FoxO1+Hcy組F Podocin 1.32±0.11 0.73±0.08a 0.72±0.04a 1.31±0.07bc 55.220＊＊Nephrin 0.58±0.08 0.36±0.01a 0.30±0.08a 0.61±0.04bc 20.110＊＊Bax∕Bcl-2 0.52±0.04 1.17±0.16a 0.91±0.11a 0.36±0.06bc 38.990＊＊Caspase12 0.55±0.05 0.92±0.14a 0.84±0.05a 0.28±0.04abc 39.580＊＊

2.6 干擾FoxO1對足細胞中Podocin、Nephrin及凋亡相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與Sh-NC+Hcy組相比，Sh-FoxO1+Hcy組中Podocin和Nephrin蛋白表達均明顯降低，Bax∕Bcl-2比值、Caspase12蛋白表達均明顯增高（P＜0.05），見圖7、表3。

Tab.3 Changes of Podocin，Nephrin and apoptosisrelated protein expression after FoxO1 interference in the four groups of podocytes表3 干擾FoxO1后各組足細胞中Podocin、Nephrin及凋亡相關蛋白的表達變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Hcy組比較，c與Sh-NC+Hcy組比較，P＜0.05。

組別對照組Hcy組Sh-NC+Hcy組Sh-FoxO1+Hcy組F Podocin 0.76±0.04 0.49±0.08a 0.54±0.05a 0.23±0.01abc 55.060＊＊Nephrin 0.89±0.08 0.56±0.04a 0.60±0.02a 0.30±0.01abc 80.500＊＊Bax∕Bcl-2 0.30±0.04 1.33±0.21a 1.47±0.23a 2.52±0.28abc 54.480＊＊Caspase12 0.26±0.03 0.64±0.09a 0.60±0.06a 0.95±0.03abc 65.120＊＊

3 討論

Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代謝的中間產物，其代謝異常引發的高同型半胱氨酸血癥（HHcy）已被證明是心腦血管疾病、慢性腎損傷、神經退行性疾病、甲狀腺功能減退、惡性腫瘤等多種疾病的獨立危險因素［9-11］。研究發現腎臟在Hcy代謝方面發揮著重要作用，HHcy是慢性腎臟病或急性腎損傷發生的常見原因［12］，但對Hcy參與腎臟損傷的分子機制研究甚少。本課題組前期研究已證明，當小鼠體內Cbs基因缺陷時血清Hcy水平明顯增高［13］。本研究通過PAS染色檢測小鼠腎小球形態學變化，發現Cbs+/+小鼠腎小球結構正常，基底膜清晰且分布均勻，而Cbs+/-小鼠腎小球基底膜呈現節段性增厚，系膜基質增多，提示小鼠血清Hcy水平升高導致腎小球結構發生異常改變。足細胞是腎單位濾過膜的關鍵成分［4］。足細胞受損是許多腎臟疾病發生發展的共同過程，如糖尿病腎病［14］、HHcy相關腎病［15］和高血壓性腎病［16］等。足細胞裂隙膜蛋白Nephrin屬于跨膜蛋白，其與Podocin蛋白結合后與細胞骨架中的肌動蛋白連接，構成濾過物質的最后一道防線，即濾過隙膜。Podocin和Nephrin表達下降可導致蛋白尿的發生，是反映足細胞損傷程度的重要指標［17］。本研究發現，Cbs+/-組與Cbs+/+組小鼠相比Podocin和Nephrin蛋白表達水平明顯降低，提示Hcy水平升高可以導致Cbs+/-小鼠腎臟足細胞損傷。

FoxO1屬于FoxO蛋白家族，目前對于FoxO1的研究較為深入，其在許多疾病的發生發展中具有重要影響，包括肝臟脂肪變性、白血病和糖尿病等［18］。此外，FoxO1還參與足細胞和系膜細胞增殖、氧化應激、細胞外基質積累和上皮-間充質轉分化的調節［19-21］，且FoxO1作為一種轉錄因子，具有調控細胞增殖和凋亡的作用［22］，但其在Hcy誘導的足細胞凋亡中的作用尚未明確。研究發現，硫化氫供體GYY4137和（或）FoxO1抑制劑AS1842856可通過調節Akt∕FoxO1通路減輕HHcy誘導的系膜細胞損傷和細胞外基質重塑［23］。本研究發現，Cbs+/-小鼠腎組織和Hcy干預后足細胞中FoxO1的表達水平均明顯降低，提示FoxO1可能參與Hcy致Cbs+/-小鼠腎小球足細胞損傷的過程。為了進一步明確FoxO1在Hcy誘導的足細胞損傷中的作用，本研究在過表達和干擾FoxO1后，檢測Podocin和Nephrin表達，發現過表達FoxO1明顯促進Podocin和Nephrin的表達，而干擾FoxO1后Podocin和Nephrin蛋白表達則明顯下降，進一步提示FoxO1參與了Hcy致小鼠腎小球足細胞損傷的過程。

細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡過程，可參與多種疾病的發生發展，而足細胞凋亡會損害腎單位濾過膜的正常結構和功能，并最終導致腎損傷［24］。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在凋亡中發揮關鍵作用，當凋亡增加時，其Bax∕Bcl-2比值升高，反之則降低［25］。Caspase12為一類半胱氨酸蛋白酶，具有調節細胞生長、分化的作用，并參與細胞凋亡，Caspase12的出現標志著凋亡過程進入不可逆階段［26］。本研究用Hcy干預足細胞后，分別轉染過表達和干擾FoxO1腺病毒檢測Bax、Bcl-2和Caspase12蛋白表達水平，發現過表達FoxO1明顯減輕足細胞凋亡，而干擾FoxO1則明顯促進細胞凋亡，表明FoxO1可以減少Hcy引起的足細胞凋亡。以上結果表明FoxO1可以明顯緩解Hcy引起的足細胞凋亡。

綜上所述，Hcy可誘導腎臟足細胞損傷，FoxO1可減輕Hcy所致的足細胞損傷，并減少足細胞的凋亡，本研究為HHcy相關腎病的防治提供了新的依據。