磷脂酰肌醇蛋白多糖3對(duì)膽道閉鎖患兒的診斷價(jià)值及與肝纖維化的關(guān)系

陳靈芝，詹江華，趙金鳳，楊芳，趙一霖，林書(shū)祥，馬慧，胡曉麗

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嬰兒期嚴(yán)重的肝膽系統(tǒng)疾病，以肝內(nèi)、外膽管梗阻，進(jìn)行性炎癥及肝纖維化為主要病理特征［1］。其首選治療方式為肝門(mén)空腸吻合（Kasai）術(shù)［2］，但是常因肝纖維化進(jìn)展迅速發(fā)展為膽汁性肝硬化，需要進(jìn)行肝移植來(lái)挽救生命［3-5］。目前BA肝纖維化機(jī)制不明，且較其他肝膽疾病造成的纖維化進(jìn)展迅速［6］。目前臨床上缺乏敏感性高的BA診斷方法，主要依賴(lài)于術(shù)中膽管造影來(lái)明確診斷。近年來(lái)，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-7、白細(xì)胞衍生趨化因子（LECT）-2等血清學(xué)標(biāo)志物用于BA的診斷正處于探索階段，發(fā)掘更多更好的血清學(xué)標(biāo)志物成為研究重點(diǎn)［7-10］。磷脂酰肌醇蛋白多糖3（Glypican 3，GPC3）是一種膜性硫酸乙酰肝素蛋白多糖，可通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨與細(xì)胞膜結(jié)合，在細(xì)胞和組織生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用［11］。GPC3可通過(guò)其硫酸乙酰肝素（HS）鏈與信號(hào)分子Wnt∕JNK［12］、Hedgehog（Hh）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖［13］。本文旨在探討GPC3水平對(duì)BA的輔助診斷價(jià)值，并分析其與BA肝纖維化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2019年3月—2020年12月因黃疸在天津市兒童醫(yī)院就診的患兒50例。其中，經(jīng)膽道造影確診為BA的患兒41例（BA組），日齡≤30 d者21例，＞30 d者20例；膽總管囊腫（choledochal cyst，CC）患兒9例（CC組）。收集肝功能正常、無(wú)其他肝膽疾病的體檢健康嬰兒12例作為正常對(duì)照組（NC組）。3組日齡分別為54（30，60）d、90（30，180）d、90（68，120）d（χ2=11.990，P＞0.05），男女例數(shù)分別為17∕24、3∕6、6∕6（χ2=0.599，P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，倫理批件號(hào)：2021-YKY-01。納入研究的所有患兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)。

1.2試劑 GPC3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司，鼠抗人GPC3一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，HRP通用型二抗、封閉用羊血清、過(guò)氧化酶封閉液、DAB染色試劑均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，cDNA試劑盒及引物購(gòu)自生工生物工程有限公司，SYBR Green master購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1肝組織纖維化程度評(píng)價(jià) 調(diào)取BA和CC患者肝組織標(biāo)本的HE病理切片，由專(zhuān)業(yè)病理科醫(yī)生根據(jù)Ohkuma’s分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估肝組織纖維化程度。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)纖維化；Ⅰ級(jí)；肝門(mén)管區(qū)輕度纖維化；Ⅱ級(jí)，臨近門(mén)管區(qū)輕度橋接纖維化；Ⅲ級(jí)，橋接纖維化擴(kuò)大；Ⅳ級(jí)，肝硬化、假小葉形成。

1.3.2ELISA檢測(cè)血清GPC3水平 收集3 mL血液樣本，離心后取上清液進(jìn)行分裝，于-20℃保存。使用前1 d將血清樣本置于4℃過(guò)夜，檢測(cè)前1 h，將血清樣本置于室溫待用。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出直線回歸方程，計(jì)算出樣本濃度。

1.3.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝組織中GPC3表達(dá) 術(shù)時(shí)取得的肝組織經(jīng)福爾馬林固定、脫水后石蠟包埋，切成4μm薄片，80℃烤片90 min。病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后置于pH=6.0的檸檬酸鈉緩沖液中，經(jīng)微波爐高溫加熱15 min進(jìn)行抗原修復(fù)。恢復(fù)至室溫后用pH=7.3的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5 min。置于10%H2O2中10 min，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。滴加羊血清封閉抗原30 min，甩干后滴加GPC3一抗（1∶100），置于冰箱4℃過(guò)夜。次日取出切片，置于室溫30 min，用PBS震蕩沖洗3次，每次5 min。滴加HRP通用型二抗孵育30 min，PBS沖洗3次后，滴加DAB試劑，顯微鏡下觀察顯色后，充分水洗，蘇木精染核，梯度乙醇脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。染色結(jié)束后，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照，200倍鏡下隨機(jī)讀取5個(gè)視野。利用Imagepro plus軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算平均光密度值（AOD），即每個(gè)視野的肝組織陽(yáng)性細(xì)胞光密度總和∕陽(yáng)性面積。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)肝組織中GPC3的表達(dá) 將新鮮的肝組織迅速過(guò)液氮，儲(chǔ)存于-80℃。按照提取RNA試劑盒提取肝組織中的總RNA，用紫外分光光度計(jì)法對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)檢，OD260∕280在1.8～2.0之間，說(shuō)明未受到DNA污染。按照cDNA試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，以cDNA為模板在LightCycler 480進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件：95℃2 min；95℃15 s，58℃30 s，70℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，記錄每孔的Ct值，以3個(gè)復(fù)孔的平均值作為最終結(jié)果，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。本研究以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，2組間均數(shù)比較獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若方差不齊，采用近似t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)及四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，多組間兩兩比較依據(jù)Bonferroni法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，根據(jù)曲線下面積評(píng)估GPC3的診斷價(jià)值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Sequence of primers for qPCR表1 qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)結(jié)果

2.1.1 血清GPC3水平 41例BA組患者中，肝纖維化Ⅰ級(jí)7例，Ⅱ級(jí)8例，Ⅲ級(jí)14例，Ⅳ級(jí)12例；9例CC組的肝組織中未見(jiàn)纖維化，為0級(jí)。ELISA結(jié)果示，BA組GPC3水平明顯高于CC組和NC組（χ2=24.170，P＜0.01），見(jiàn)圖1。BA組內(nèi)日齡≤30 d及＞30 d的患兒血清GPC3水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于CC組和NC組（χ2=24.210，P＜0.01），見(jiàn)圖2。BA組內(nèi)Ⅰ～Ⅱ級(jí)與Ⅲ～Ⅳ級(jí)GPC3水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于CC組和NC組（χ2=24.390，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

Fig.1 Comparison of the serum GPC3 levels between the groups圖1 各組血清GPC3水平比較

2.1.2 ROC曲線分析 血清GPC3診斷BA的ROC曲線下面積為0.878（95%CI：0.792～0.965，P＜0.01），最佳臨界值為0.639μg∕L，敏感度為82.93%，特異度為80.95%，見(jiàn)圖4。

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 肝組織中GPC3表達(dá)情況 GPC3陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，BA組肝組織中GPC3定位于肝細(xì)胞胞質(zhì)中，呈顆粒樣表達(dá)，而CC組未見(jiàn)GPC3陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖5。與CC組相比，GPC3在BA組的表達(dá)明顯增加［AOD：0.238（0.180，0.330）vs.0.000（0.000，0.006），Z=3.565，P＜0.01］。

Fig.2 Comparison of the serum GPC3 levels between the four groups圖2 不同日齡BA患兒與其他2組血清GPC3水平比較

Fig.3 Comparison of serum GPC3 levels between BA children with different hepatic fibrosis grades and the other two groups圖3不同肝纖維化分級(jí)BA患兒其他2組血清GPC3水平比較

Fig.4 ROC curve of GPC3 in the diagnosis of BA圖4 GPC3診斷BA的ROC曲線

2.2.2 BA患兒肝組織GPC3表達(dá)與纖維化分級(jí)的關(guān)系 GPC3在Ⅲ～Ⅳ級(jí)中的表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)（AOD：0.296±0.060vs.0.199±0.880，t=3.941，P＜0.01）。肝組織中GPC3表達(dá)水平與肝纖維化分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.619，P＜0.01），即隨著肝纖維化程度的加重，肝組織中GPC3蛋白表達(dá)增加。

2.3 qPCR結(jié)果 BA組GPC3 mRNA表達(dá)與CC組相 比 明顯上調(diào)［9.53（8.50，32.13）vs.1.00（1.00，1.00），Z=7.361，P＜0.01］。

Fig.5 The GPC3 expression in liver tissues of children with BA and choledochal cyst(immunohistochemical staining，×200)圖5 BA患兒與膽總管囊腫患兒肝組織GPC3表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

3 討論

BA是嬰兒期嚴(yán)重的肝膽系統(tǒng)疾病，纖維化進(jìn)展迅速，預(yù)后不佳，如果不及時(shí)治療，常在2歲左右死亡［6］。在胚胎形成的過(guò)程中，GPC3在胚胎期未分化肝細(xì)胞中高表達(dá)，然后表達(dá)量逐漸減少，出生3周后，肝臟中未檢測(cè)出GPC3的mRNA和蛋白質(zhì)［14］。目前，肝臟病理學(xué)檢查是評(píng)估肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但考慮到肝活檢是一項(xiàng)有創(chuàng)性檢查，不便對(duì)患兒反復(fù)檢測(cè)。近幾年來(lái)，無(wú)創(chuàng)性肝纖維化的診斷是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)，目的是探索一種創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)監(jiān)測(cè)的肝纖維化檢查技術(shù)。本研究旨在探究血清中GPC3水平診斷BA的臨床價(jià)值，進(jìn)一步檢測(cè)其在BA肝組織中的表達(dá)以及其與肝纖維化分級(jí)的關(guān)系。

3.1 血清GPC3診斷價(jià)值分析 BA診斷主要依賴(lài)于術(shù)中膽管造影，對(duì)患兒傷害較大，不適合作為臨床篩查手段，血清學(xué)檢測(cè)簡(jiǎn)單易行，對(duì)患兒損傷小，且可以反復(fù)檢測(cè)。GPC3雖然是細(xì)胞表面標(biāo)志物，但它可以通過(guò)裂解糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白的脂肪酶Notum釋放到血清中［15］。因此當(dāng)組織標(biāo)本難以獲取時(shí)，可檢測(cè)血清GPC3蛋白量，用于診斷和治療。膽總管囊腫和BA患兒臨床癥狀相似，但手術(shù)方式和預(yù)后截然不同［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，BA組血清GPC3水平明顯高于CC組，表明GPC3升高與BA具有相關(guān)性，檢測(cè)血清GPC3可有助于鑒別診斷BA；且BA組內(nèi)年齡≤30 d患兒血清GPC3水平高于CC組和NC組，年齡≤30 d的患兒中，最小1例年齡為54 h，血清GPC3仍高于CC組和NC組，最終手術(shù)證實(shí)為BA患兒，提示早期檢測(cè)血清GPC3水平對(duì)BA的診斷有臨床意義。

3.2 GPC3表達(dá)與BA肝纖維化分級(jí)關(guān)系 GPC3對(duì)BA的診斷及鑒別診斷有一定臨床價(jià)值，故本研究進(jìn)一步探究其在肝組織的表達(dá)情況，免疫組化結(jié)果顯示，BA組肝組織中GPC3蛋白表達(dá)較CC組上調(diào)，且隨著纖維化程度加重，表達(dá)逐漸上調(diào)，GPC3在肝纖維化Ⅰ～Ⅱ級(jí)的表達(dá)明顯低于Ⅲ～Ⅳ級(jí)，這表明GPC3的異常表達(dá)與BA肝纖維化密切相關(guān)。Udomsinprasert等［17］認(rèn)為這可能是機(jī)體對(duì)肝細(xì)胞損傷的一種防御反應(yīng)。本研究中肝組織GPC3水平與纖維化分級(jí)相關(guān)，但血清標(biāo)本中無(wú)明顯差異，可能是由于采集血清后肝纖維化仍在進(jìn)展所致。后期仍需采集手術(shù)時(shí)血清來(lái)進(jìn)一步探究其與肝纖維化的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)BA組與CC組相比GPC3 mRNA表達(dá)上調(diào)。有研究報(bào)道GPC3的表達(dá)與α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）呈正相關(guān)［17］，而α-SMA與肝纖維化強(qiáng)相關(guān)，是肝星狀細(xì)胞活化的特征性標(biāo)志物。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了GPC3參與BA肝纖維化。另有研究證實(shí)，敲低小鼠GPC3基因時(shí)會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)，這表明GPC3表達(dá)升高時(shí)抑制肝細(xì)胞再生，預(yù)后不良［18］。GPC3參與BA肝纖維化的具體機(jī)制有待細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

綜上所述，GPC3 mRNA及蛋白在BA中均高表達(dá)，且肝組織中的蛋白含量與肝纖維化密切相關(guān)。GPC3可能與多種通路相互作用，參與BA肝纖維化過(guò)程，可成為診斷BA的特異性血清標(biāo)志物。