大麥草青貯優良菌株選育與應用

安 琦，曹亞彬，牛彥波，原 韜

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

大麥草是具有豐富營養價值且耐鹽堿的優質牧草。我國養殖業規模逐漸擴大，牧草需求也不斷增加[1]，在探索和尋求飼料原料新來源的過程中，開發利用鹽堿土地，種植高耐受性作物大麥草被認為是解決畜牧飼料匱乏的辦法之一。大麥草具有多種飼喂方式，不但能夠直接放牧進食，還可以制備便于存儲的青貯飼料或曬制成干草。不論是青貯或是干草，都可以滿足牧草短缺季節飼料供應的需求。與干草相比，青貯具備更好的適口性和更豐富的營養，能夠為進食動物建立更健康的腸道體系，提高畜禽綜合免疫能力。因此，與晾曬干草相比，青貯大麥草是更加科學合理的貯存方式[2]。經過青貯制備后的大麥草飼料富含豐富的蛋白質，青貯過程中維生素、礦物質得到了充分保留，為進食動物獲取均衡的營養來源提供了充分保障。經過青貯發酵后，大麥草口感得到進一步提升，具備了與水果相似的香味，可促進動物進食。

目前，在大麥草青貯生產中還存在不少技術難題，其中比較突出的問題是大麥草本身附著乳酸菌少，青貯生產若使用天然乳酸菌，發酵速度較慢，不利于生產，會造成較大的經濟損失[3-4]。市面上缺乏適用于大麥草青貯的專用青貯接種劑，外源接種劑普遍難以適應大麥草青貯環境，應用后競爭能力低、發酵啟動慢、生產中會造成比較大的物料消耗[5-6]。以大麥草作為初始底物，經過篩選鑒定得到產酸桿菌共11株，針對這些菌株開展產酸檢測，篩選出優良菌株，利用16sr DNA方法檢測，通過BLAST比對，得到1株優良的大麥草青貯發酵菌株，確定為植物乳桿菌。通過與野生大麥草乳酸菌及市售非專用青貯菌株進行對比，分離純化得到的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)在生長速度、產酸能力、發酵青貯品質等方面具有優勢，有望應用于大麥草青貯生產中。

1 材料與方法

1.1 材料

大麥草自然青貯樣品由飼料企業提供；植物乳桿菌1431、1426株分離自玉米秸稈青貯飼料和市售青貯接種劑商品。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選與鑒定

采集自然大麥草青貯作為實驗樣品，按比例稀釋后，利用加鈣的MRS固體培養基進行篩選。采用平板稀釋方法分離乳酸菌菌株，在平板上挑取溶鈣圈較大的菌落，純化菌株，轉接斜面培養基保存。復篩使用MRS液體培養基(添加4%葡萄糖)，接種后28℃靜止培養48 h后采用滴定法檢測總酸。復篩選生產菌株，切碎的大麥草與水按1∶3比例混合攪勻后進行過濾，濾液中補加0.5%葡萄糖，接種目的菌株后于28℃靜置培養，定期檢測菌株的生長速度快和產酸能力，選取生長速度快、產酸能力強的菌株進行16srDNA鑒定。

1.2.2 大麥草青貯制備

將大麥草切碎至約4 cm后進行滅菌處理，接種2.5%乳酸菌菌液后充分混合，用抽真空袋進行分裝，每袋裝入約500 g大麥草，于28℃靜置培養，定期檢測總酸與pH。

1.2.3 青貯生產實驗

粉碎的大麥草與稻糠按10∶1進行混合后接種2.5%乳酸菌菌液，充分混勻，密封打包后室溫放置30 d，定期開包檢查青貯效果，每次生產可加工7 t大麥草。

1.2.4 數據處理與分析

所有采集數據采用 Excel 軟件進行前期處理，用 SPSS 19.0 進行統計分析，進行多重比較，結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 初篩菌株的分離及產酸能力檢測

在自然大麥草青貯樣品中分離出目的菌株11株。對初篩菌株于4%葡萄糖MRS液體培養基中28℃靜止培養48 h后，檢測其總酸含量，結果如表1。初篩菌株1729、1723、1730的產酸能力較高，與其他菌株存在顯著性差異(P<0.05)。

表1 初篩菌株產酸能力測定Tab.1 Determination of acid production capacity of primary screening strains

2.2 復篩菌株生長速度檢測

乳酸菌在青貯中的起始濃度和生長速度對青貯至關重要。為了篩選出具有生長優勢的乳酸菌，對復篩菌株1723、1729、1730的生長速度進行簡單的測定，相同的培養條件下，菌株1723的菌體數量顯著高于菌株1729和1730(P<0.05)，生長速度顯著快于其他菌株。

表2 復篩菌株菌體生長速度Tab.2 Growth rate of re-screened strains

2.3 菌株對大麥草的青貯能力

將篩選出的大麥草青貯菌株1723、分離自玉米秸稈青貯飼料的菌株1431、分離自市售青貯接種劑商品1426共3株植物乳桿菌的產酸情況進行比較，每隔12 h監測其產酸情況。結果如表3所示，在青貯前期8 h、16 h，大麥草青貯菌株1723產酸速度顯著快于其他兩株非專用菌株。24 h后，菌株1723和菌株1431的產酸值具有顯著性差異，與菌株1426無顯著差異性。由此可見，在青貯前期菌株1723具有顯著性的產酸優勢(P<0.05)。

表3 不同菌株對大麥草的青貯能力Tab.3 Silage capacity of different strains to barley grass

2.4 菌株鑒定結果

對菌株1723進行鑒定，如圖1所示，經16srDNA擴增后，在1 700 bp左右出現目的擴增產物。對擴增產物進行測序后，與Genbank進行序列BLAST比對，結果如圖2所示，目的菌株1723與植物乳桿菌的相似度為99%。

圖1 目的菌株的比對結果Fig.1 Comparison results of target strains

圖2 目的菌株的比對結果Fig.2 Comparison results of target strains

2.5 青貯的發酵品質

使用植物乳桿菌1723、1426、1431對大麥草進行青貯30 d后對其發酵品質進行評估。如表4所示，感官指標顯示，青貯物料均未腐敗，呈現綠黃色，伴有清香甜味。大麥草專用菌株1723的青貯pH和氨肽氮/總氮顯著低于其他兩組(P<0.05)，而其有機酸含量和中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維指標差異不顯著(P>0.05)。

表4 青貯的發酵品質Tab.4 Quality of ferment Silage

3 討論

隨著畜牧產業的發展，飼料原料來源覆蓋日益廣泛。大麥草具有豐富的營養，是新興的飼料原料[7]。大麥草可以制備為青貯飼料，應用于冬春季飼喂。青貯飼料與干飼料相比，適口性好，營養價值高[8-9]。在制備青貯飼料的過程中，由于大麥草攜帶乳酸菌數量低，依靠自身乳酸菌進行天然發酵速度較慢，發酵效果不理想[10-11]。若采用市售通用青貯接種劑，外源乳酸菌對大麥草適應性較低，缺乏環境競爭力，生產中易造成較大損失。因此，由大麥牧草出發分離純化適用于大麥牧草的青貯用乳酸菌株具有較高的應用價值，經過分離篩選，核酸水平鑒定，分離出源自大麥牧草的植物乳桿菌菌株。經過產酸能力檢測、生長速度測定與回接青貯實驗，與野生乳酸菌株和非大麥草青貯商品菌株進行對比，生長速度產酸能力均優于野生及非專用商品菌株。該菌株作為大麥牧草來源的青貯飼料發酵專屬菌株，具有更好的物料適應性，更高的發酵環境競爭優勢，可提高生產速度，降低生產過程中的物料損失，提高了大麥牧草產品品質和生產利潤，有望在大麥牧草青貯生產中推廣應用。