海馬高級糖基化終末產物受體和β-淀粉樣前體蛋白裂解酶表達增加與自發性高血壓大鼠認知功能損害相關性研究

黃 冬，苗 銳，李 陽，郭 濤，張曉梅，楊榮軍，趙凱濤，梁軍麗，王 磊

(1.陜西省第二人民醫院神經內科,陜西 西安710005;2.陜西省第二人民醫院急診科,陜西 西安710005)

高血壓，也稱為動脈血壓升高，表現為收縮壓大于140 mm Hg，舒張壓大于90 mm Hg，是一類廣泛的公共健康問題。在中國，其發病率逐年上升，在35～75歲的成年人中，將近一半的人均患有高血壓，其中只有不到三分之一的人接受了治療，不到十二分之一的人有效地控制了血壓數值[1]。目前，高血壓已經成為首位導致人早逝的疾病，因為它常常會伴隨其他疾病產生，比如腦卒中、心衰等[2]。近些年發現高血壓與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的發生相關[3]。由于高血壓引起血管重構，會導致一些心腦血管疾病和血管性癡呆，但是其中的機制尚不明確。

AD是癡呆最常見的一種類型，在全世界患病人數超過3.39千萬[4]。AD的最主要病變為細胞外海馬β淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)斑塊形成和細胞內τ蛋白過度磷酸化導致的神經纖維纏結[5]。癡呆引起的認知功能障礙一般是認為與海馬密切相關[6]。近些年海馬高級糖基化終末產物受體(Receptor for advanced glycation end-products,RAGE)被報道可以誘導高血壓動物腦中Aβ蛋白的沉積，造成認知損害[7]。過量Aβ聚集是由Aβ前體蛋白(Amyloid-β precursor protein,APP)代謝異常而引起，在體內，APP主要通過β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)清除，從循環血液中進入腦內主要是通過RAGE介導[8]，因此RAGE與BACE1很有可能與自發性高血壓大鼠(Spontaneous hypertension rats,SHR)認知功能損害密切相關，本研究將通過在SHR模型上，探究海馬區RAGE與BACE表達變化與SHR認知功能損害之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究所用動物為SHR與正常血壓大鼠(Normotensive wistar rats,NWR)。動物飼養在環境溫度與濕度均可控的實驗動物中心，環境照明為12 h明/暗。所有實驗均符合本院實驗動物管理條例。

1.2 實驗方法

1.2.1 NWR與SHR的增強型磁共振成像(MEMRI)[9]：用雙蒸水作為溶劑配置MnCl2溶液(Sigma Aldrich,USA)。在成像之前22 h，所有動物腹腔注射MnCl2溶液(70 mg/kg)，注射完后放回原籠子中飼養。在成像當天，用3%～4%的異氟烷麻醉動物。采用4.7T的Magnex Scientific MR scanner進行成像拍攝，使用軟件為Agilent Technologies Vnmr J 3.1。

1.2.2 Morris水迷宮[10]：在圓形池加入添加有白粉的水，水溫保持在22～23 ℃。在第1～3天時，在水面有一略高出水面的平臺，將大鼠面向池壁，分別從四個入水點放入水中，重復3輪，記錄大鼠找到平臺的時間。在第4天時，隱藏平臺的位置，重復之前的操作，記錄大鼠在看不見平臺位置時，尋找到平臺的時間，考察大鼠對原平臺的記憶。

1.2.3 新事物識別:在進行新事物識別實驗前，每天撫摸實驗大鼠1 min，避免刺激大鼠。在進行實驗前24 h，將動物放在測試房間內，適應環境。在訓練階段，將兩個相同的物體放在同一側箱壁的左右兩端，將大鼠背朝兩物體且處于兩物體中線位置，靠近箱壁放入箱子中，放入后立即開啟錄像設備，實驗者離開測試房間。記錄時間持續5 min，記錄每一只大鼠與兩個相同物體分別接觸的時間。在測試階段，將其中一個物體換為另外一個新物體，同樣的方式，記錄每只大鼠在測試階段對舊物體與新物體分別的接觸時間。每只大鼠訓練階段與測試階段間隔2 h。每換下一只大鼠前，將箱子與物體用酒精擦去氣味。測試結束后，將大鼠放回原來的飼養籠子中。

1.2.4 Western blot:將勻漿機置于冰上，預冷離心機，取出大鼠的全腦，在冰上分離海馬組織，用剪刀剪成小塊，稱取0.1 g組織，置于干凈的離心管中，加入1 ml RIPA裂解液(Beyotime,上海)裂解，電動勻漿機充分勻漿2～3 min，用離心機在4 ℃，12000 r/min離心15 min，取上清置于新的離心管中，進行超聲破碎。取5 μl樣品，用BCA試劑盒(Beyotime,上海)進行蛋白濃度測定。

將蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內，電壓設置100 V，時間90 min。濕法轉移至PVDF膜上，進行封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影和曝光等過程。

一抗包括：rabbit polyclonal anti-BACE1 (1∶1000;B0681,Sigma-Aldrich) ；mouse monoclonal anti-β-actin (1∶5000;A5316,Sigma-Aldrich)；rabbit polyclonal anti-RAGE antibody (1∶800;ab3611,Abcam)。

1.2.5 免疫蛋白反應:采用標準的ABC(Avidin-Biotin Complex)法對Aβ斑塊進行染色。所用一抗為mouse monoclonal anti-Aβ6E10(1∶1000;SIG-39300,Covance)。ABC法處理完成后，用DAB試劑盒按照標準實驗步驟進行后續染色。

1.3 統計學方法 MEMRI數據處理按照已經發表的實驗方法進行成像數據處理[11]。Morris水迷宮實驗和新事物識別實驗以及Western blot采用SPSS軟件(Version 20)，計量資料用均值±標準差表示，采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SHR大鼠海馬在MEMRI中活動降低 在MEMRI的圖片中(圖1)，我們統計了NWR與SHR兩組大鼠海馬位置的信號強度(Signal intensity,SI)，發現SHR比NWR表現出較弱的核磁信號強度(0.698與1.499，P<0.01)，提示在SHR中，海馬腦區神經元活動較低，海馬功能異常。

A、B：NWR與SHR大鼠MEMRI,紅線和箭頭指示位置為海馬腦區；C：A、B圖對應腦圖譜位置；D：NWR與SHR大鼠海馬MEMRI核磁信號平均強度。*與NWR比較，P<0.01

2.2 SHR空間記憶能力下降 通過Morris水迷宮實驗，我們訓練了SHR與NWR，在訓練的第1天到第3天，SHR找到平臺的時間與NWR相比，沒有統計學差異。在第4天的測試階段，SHR找到隱藏在水面下平臺的時間，比NWR要長(35.3與12.2，P<0.01)，提示SHR的空間記憶能力受損。見圖2。

A：NWR與SHR在迷宮中運動軌跡圖；B：NWR與SHR從入水點到達平臺所用的時間。*與NWR比較，P<0.01

2.3 SHR短期記憶能力受損 在新事物識別實驗的訓練階段，SHR與NWR對兩個相同物體表現出類似的探索行為：對兩個物體的探索時間一樣，表明大鼠對左右沒有偏好性，同時NWR與SHR對兩個物體的探索時間長短沒有統計學差異。當測試階段將其中一個舊物體更換為一個大鼠沒有見過的新物體，記錄每只大鼠對舊物體與新物體的探索時間，發現NWR與SHR對舊物體的探索時間相似，但是SHR對新物體的探索時間比NWR顯著降低(13.7與31.5，P<0.01)，提示SHR的短期記憶能力受損。見圖3。

A：訓練階段以及測試階段示意圖；B：測試階段，NWR與SHR對舊事物與新事物的探索時間。*與NWR比較，P<0.01

2.4 RAGE在SHR海馬部位蛋白表達水平顯著升高 我們分離了大鼠的海馬腦區，并用Western blot 檢測了RAGE蛋白的變化。通過灰度對比檢測，我們發現SHR海馬部位的RAGE蛋白表達量相比NWR組顯著升高(0.407 與0.789，P<0.05)。見圖4。

A：RAGE蛋白與內參Actin在海馬部位的Western blot條帶；B：RAGE的灰度值統計。*與NWR比較，P<0.05

2.5 BACE在SHR海馬部位蛋白表達水平顯著升高 我們還檢測了在海馬部位的BACE蛋白表達水平，在SHR的海馬腦區中，BACE蛋白的表達量相比NWR顯著增加(0.733 與 1.502,P<0.01)。見圖5。

A：BACE蛋白與內參Actin在海馬部位的Western blot條帶；B：RAGE的灰度值統計。*與NWR比較，P<0.01

2.6 淀粉樣斑塊Aβ 在SHR海馬腦區中表達顯著增加 通過免疫蛋白反應，我們對NWR與SHR的海馬切片進行染色，觀察到在NWR中，海馬腦區未觀察到Aβ陽性信號，而在SHR中，觀察到大量的淀粉樣棕色斑塊沉積，即為Aβ。見圖6。

A、B：NWR與SHR海馬腦區Aβ染色圖；C、D：分別對應A、B中海馬腦區放大圖。A-B：標尺=1 mm;C-D:標尺=200 μm

3 討 論

目前全世界有三分之一的成年人都患有高血壓，在年齡超過65歲的人群中，其患病率可以達到三分之二[12-13]。未來2025年，患高血壓人數將可能增長到15.6億人。癡呆(Dementia)的患病率會隨著年齡的增長呈指數增加，65歲以上的人群，每5年，患病概率會加倍[14]。目前已有明確證據表明，高血壓會造成一系列腦疾病，包括認知能力下降、阿爾茲海默病和血管性癡呆等[15-17]。在患有認知功能障礙的人群中，大部分都患有高血壓[18]。但是目前對于高血壓中認知功能是如何發生變化的，機制還沒有完全明確。因此亟須明確高血壓中，造成認知功能改變的因素。

RAGE是一個多配體受體，其主要配體為糖化反應終端產物(Glycation end products)，除此外，還能介導外周Aβ向腦內的轉運過程[19]。Aβ 的過量產生與沉積，是引起AD的主要原因之一，因此RAGE可能是通過影響Aβ 在腦內的沉積過程，從而引起認知功能的變化。BACE是一類跨膜蛋白，它可以通過水解APP蛋白而產生Aβ，在AD患者腦中已經發現BACE的表達上調，臨床在研藥物包括BACE的抑制劑，可以通過抑制BACE活性，從而抑制Aβ的產生，對AD的發病進程產生影響[20]。BACE和RAGE均可以通過促進Aβ的產生，造成認知功能損害。

我們通過自發性高血壓大鼠(SHR)與正常血壓大鼠(NWR)，對高血壓中認知功能發生改變的這一現象，進行了相關研究。通過MEMRI，我們觀察到SHR相比NWR，海馬區域腦活動降低，提示SHR的海馬功能受到抑制；通過水迷宮與新事物識別等行為學實驗，也觀察到SHR的空間記憶以及短期記憶能力降低，即認知功能受損。進一步我們分別檢測了海馬區域RAGE與BACE的蛋白表達水平，在SHR中，兩種蛋白的表達水平均顯著升高，提示海馬區域功能降低、認知功能受損可能是由于RAGE與BACE的表達量增加有關。我們又通過免疫蛋白反應檢測了NWR與SHR的Aβ蛋白表達情況，在NWR中，我們幾乎沒有觀察到Aβ的表達，而在SHR中，海馬區域有大量淀粉樣的蛋白表達，即為Aβ的沉積。

本研究將為SHR中認知功能變化的基礎研究與臨床研究提供理論基礎，但是在SHR中，海馬腦區的RAGE與BACE是如何增加的，還需要進行深入研究。