轉錄因子NR4A2對乳腺癌細胞增殖與凋亡的調節作用*

蔡明, 袁榮華，楊逸凡

(南通大學第二附屬醫院 甲乳外科, 江蘇 南通 226000)

乳腺癌為女性最常見癌癥類型，1980—2010年乳腺癌發病年增加率達3.1%[1]，估計到2030年全世界乳腺癌新發病例將近220萬[2]。乳腺癌已成為當前女性癌癥死亡的主因，占所有癌癥死亡的14.3%[3-4]。由于對腫瘤早期診斷和綜合治療策略的進步，乳腺癌患者的預后得到一定改善[5]。研究表明，轉錄因子(transcription factors，TFs)在乳腺癌細胞的增殖、入侵和遷移中發揮重要作用[6-8]，內源性配體的核孤立受體在生長發育、細胞平衡和癌癥發生進展中亦發揮作用，其中某些受體的表達過度或下調對患者的生存具有預測意義[9-11]。孤兒受體表現出腫瘤特異性的致癌或腫瘤抑制劑樣活性[12]。核孤立受體NR4A2作為轉錄因子，已被證實具有一定腫瘤抑制作用[13-15]。在胰腺癌、結腸癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌等細胞系中過表達NR4A2可誘發腫瘤細胞生長抑制，并下調細胞增殖、遷移和侵襲能力[16-18]。目前，關于NR4A2在乳腺癌中的研究較少[19]。本研究采用乳腺癌細胞MCF-7細胞系進行NR4A2過表達和干擾處理，觀察NR4A2對乳腺癌細胞增殖和凋亡的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人正常乳腺上皮細胞MCF 10A和乳腺癌細胞系HBL101、MDA-MD-435、MCF-7和HS598T細胞系(ATCC，中國)，10%胎牛血清(Gibco，USA)，50 U/mL青霉素(Gibco，USA)，100 mg/L鏈霉素(Gibco，USA)，RPMI1640培養基(Gibco，USA)，oe-NR4A2、si-NR4A2和si-NC質粒(上海吉瑪公司，中國)；磷酸鹽緩沖液(賽默飛世爾，USA)，Lipofectamine 2000(賽默飛世爾，USA)，Trizol(賽默飛世爾，USA)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司，中國)。RIPA裂解液(R0010，solarbio)，BCA試劑盒(賽默飛世爾，USA)，PVDF膜(ISEQ00010，Millipore，Billerica，MA，USA)，兔抗人NR4A2(ab54366)、PCNA(ab92552)、Bax(ab32503)、Bcl-2(ab32124)和GAPDH(ab8226 Abcam，UK)，HRP標記羊抗兔IgG抗體(北京中山生物技術有限公司)，ECL熒光檢測試劑盒(BB-3501，Ameshame，UK)。CCK8(Sigma，USA)，酶標儀(北京諾亞威儀器儀表有限公司，中國)，胰酶(賽默飛世爾，USA)，Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Sigma，USA)，HEPES緩存液(賽默飛公司，USA)。細胞培養箱(thromo3111，USA)，ABI PRISM?7300系統(Prism?7300，上海坤科儀器設備有限公司，中國)，Bio-Rad圖像分析系統(BIO-RAD，USA)，酶標儀(北京諾亞威儀器儀表有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 分別將人正常乳腺上皮細胞MCF 10A和乳腺癌細胞系HBL101、MDA-MD-435、MCF-7、HS598T細胞系置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中，用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養基中進行培養，每天更換培養基，3～4 d傳代，選擇對數生長期且生長狀態較好的細胞進行實驗。

1.2.2細胞分組 取對數生長期的人乳腺癌MCF-7細胞系按1×105/孔密度接種于6孔培養板內，轉染前1天用不含血清和雙抗的RPMI 1640培養基培養。細胞分別轉染oe-NC(oe-NC組)、si-NC(si-NC組)、NR4A2過表達質粒(oe-NR4A2組)和si-NR4A2干擾序列(si-NR4A2組)，按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染。將2 μg oe-NR4A2質粒、50 ng si-NR4A2干擾序列或si-NC快速離心，加入170 μL磷酸鹽緩沖液后混勻，靜置5 min；后加8 μL Lipofectamine 2000，輕蕩混勻，室溫下靜置20 min，添加5 μmol/LDAPT；將以上混合液加入6孔板，輕輕混勻；轉染后8 h更換為含10%胎牛血清的培養基。轉染48 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1qRT-PCR檢測NR4A2、PCNA、Bcl-2和Bax的mRNA表達水平 收集轉染48 h后的各組細胞，Trizol提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行熒光定量PCR檢測。依次加入以下組分：25 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)，各2 μL PCR上、下游引物，l μL ROX Referesi-NCe Dye參比染料(50×)，4 μL DNA模板，以及16 μL ddH2O。采用ABI PRISM?7300系統進行熒光定量PCR，反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，循環32次后72 ℃延伸1 min。ΔCt=CT目的基因-CTGAPDH，ΔΔCt=Ct實驗組-ΔCt對照組，以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt表示各目的基因相對表達量。引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2Western blot檢測NR4A2、PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達 各組細胞轉染48 h后，預冷PBS洗3遍，以含PMSF的RIPA裂解液提取細胞中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，去離子水調零。加入50 μg蛋白樣品，70 V恒壓電泳3 h。濕轉法將蛋白轉至PVDF膜，恒流150 mA轉膜。5%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h。TBST洗膜后，加入一抗兔抗人NR4A2(1∶2 000)、PCNA(1∶5 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)及GAPDH(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗3 次，每次6 min。加入HRP標記羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)孵育2 h。重復TBST洗膜，取ECL熒光檢測試劑盒A液和B液、等體積混勻，200 μL滴于膜上，在凝膠成像儀中曝光成像。應用Bio-Rad圖像分析系統采集圖像，以Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值，表示相對蛋白含量。

1.3.3CCK8法檢測各組細胞增殖水平 取對數生長期的各組細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養基制備成1×104個/mL的細胞懸液，接種至96 孔培養板，每組各設8孔，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養；培養48 h取出培養板，每孔加入10 μL CCK8繼續培養1 h。應用酶標儀于450 nm處讀取各孔吸光度值(OD)值。

1.3.4集落形成實驗 取對數生長期細胞接種于75 mm平皿內(細胞懸液中單個細胞比例>95%)，每皿800個細胞，各加入3%瓊脂1 mL(已融化，65 ℃水浴中放置)，迅速加入并混勻；培養48 h后，磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)洗滌2次，甲醇固定20 min，10% Giemse染色20 min，去離子水沖洗，晾干。解剖鏡下計數每皿>20個細胞以上的集落數，計算集落形成率。

1.3.5流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況 細胞轉染48 h后，用不含EDTA胰酶消化并收集細胞于流式管中，2 000 r/min離心30 min，棄上清。預冷PBS洗滌3次后，2 000 r/min重復離心20 min，棄上清；按照Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書，將HEPES緩存液、Annexin-V-FITC與PI(50∶1∶2)配成Annexin-V-FITC/PI染液，加入染液100 μL混勻，室溫孵育15 min后加入 HEPES緩存液1 mL 振蕩混勻。應用流式細胞儀檢測細胞凋亡，檢測器激發波長488 nm。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 NR4A2在乳腺上皮細胞及各乳腺癌細胞系中的表達

與人正常乳腺上皮細胞MCF 10A比較，乳腺癌HBL101、MDA-MD-435、MCF-7及HS598T細胞系中NR4A2 mRNA表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，其中MCF-7細胞系中表達量最低，故選擇該細胞進行后續實驗。見圖1。

注：(1)與人正常乳腺上皮細胞MCF 10A比較，P<0.05。

2.2 轉染后各組NR4A2 mRNA表達

與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞NR4A2 mRNA表達量升高；而與si-NC組比較，si-NR4A2組NR4A2 mRNA表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組NR4A2 mRNA表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.3 轉染后各組NR4A2蛋白表達

與oe-NC組比較，oe-NR4A2細胞NR4A2蛋白表達量升高；而與si-NC組比較，si-NR4A2組NR4A2蛋白表達量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組NR4A2蛋白表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：A為各組細胞NR4A2蛋白條帶圖，B為各組細胞NR4A2蛋白水平統計圖；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.4 轉染后各組細胞增殖能力

與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞OD值降低；而與si-NC組比較，si-NR4A2組OD值升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組增殖能力比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.5 轉染后各組細胞集落形成能力

與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞集落形成數減少；而與si-NC組比較，si-NR4A2組細胞集落形成數增多，差異均有統計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組集落形成數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

注：A為各組細胞集落形成情況(100×)，B為各組細胞集落形成數統計圖；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.6 轉染后各組細胞凋亡情況

與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞凋亡率升高；而與si-NC組比較，si-NR4A2組凋亡率降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；oe-NC組和si-NC組細胞凋亡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

注：A為流式細胞術檢測各組細胞凋亡流式率，B為各組細胞凋亡率統計圖；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.7 PCNA、Bcl-2和Bax mRNA表達

為研究NR4A2是如何影響乳腺癌細胞發生發展的，本研究通過qRT-PCR檢測增殖相關因子PCNA及凋亡相關因子Bcl-2和BaxmRNA的表達，結果顯示(圖7)，與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞的PCNA、Bcl-2 mRNA表達水平降低，BaxmRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與si-NC組比較，si-NR4A2組PCNA、Bcl-2 mRNA表達水平上升，BaxmRNA表達水平下調，差異有統計學意義(P<0.05)。oe-NC組、si-NC組細胞PCNA、Bcl-2和BaxmRNA表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

注：(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

2.8 PCNA、Bcl-2和Bax蛋白表達

與oe-NC組比較，si-NC組各基因表達比較，差異無統計學意義(P> 0.05)。與oe-NC組比較，oe-NR4A2組細胞PCNA、Bcl-2蛋白表達水平明顯減少，Bax蛋白表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.05)。與si-NC組比較，si-NR4A2組PCNA、Bcl-2蛋白表達水平上調，Bax蛋白表達水平下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖8。

注：A為各組細胞PCNA、Bcl-2和Bax的蛋白條帶圖，B為各組細胞PCNA、Bcl-2和Bax的蛋白表達統計圖；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。

3 討論

既往研究報道，早期乳腺癌干預更有利于提高患者生存率[20]。同時，了解乳腺癌發生機制有助于制定有效防治策略[21]。然而，驗證已識別基因及其分子機制以供臨床應用有待進一步研究。乳腺癌中已發現數個小異常代謝途徑、潛在生物標志物和藥物靶基因，但其具體分子網絡尚未清晰[22-25]。核受體是積極參與人類生理學和病理學進程的轉錄因子，可調節下游分子事件并調節復雜基因調控網絡[26]。核受體是一類高度保守的配體依賴性轉錄因子家族，后者可調控正常人體組織和腫瘤組織的許多關鍵過程[27]。大多數成員受經典配體激素調節，但孤核受體是沒有配體或尚未發現配體的核受體[28]。數十種孤核受體廣泛分布于機體各組織，在胚胎發育、新陳代謝和晝夜節律調節中起著關鍵作用[29]。因此，選擇性孤核受體調節劑的篩選和開發在腫瘤治療中具有重要臨床意義[30]。

惡性腫瘤以不受控制的腫瘤生長、侵襲性和轉移為特征，且涉及多種突變事件，包括轉錄因子。在本研究中，過表達NR4A2可抑制細胞增殖和集落形成，促進細胞凋亡，同時PCNA和Bcl-2表達明顯減少，Bax表達上升；而對NR4A2表達進行干擾后，細胞增殖和集落形成均顯著活躍，細胞凋亡被抑制，同時PCNA和Bcl-2表達明顯增加，Bax表達下調。提示NR4A2可能通過改變癌細胞增殖相關抗原蛋白和凋亡相關蛋白表達從而對乳腺癌細胞增殖和凋亡發揮作用。因此，本研究揭示NR4A2在乳腺癌中具有一定抑癌作用。本研究推測NR4A2過表達可抑制MCF-7乳腺癌細胞系增殖和集落形成，并促進其凋亡；反向干擾NR4A2進一步雙向證實本研究結論。

通過本課題，本研究推測NR4A2對MCF-7乳腺癌細胞系增殖、凋亡、集落形成能力的影響，并認為NR4A2對乳腺癌具有一定抑制作用。NR4A2對乳腺癌的影響機制與其調節其細胞增殖和凋亡，并影響相關蛋白的表達相關。NR4A2有可能是治療乳腺癌的潛在分子靶標，未來進一步探討NR4A2分子機制具有重要有意義。然而截至目前，本研究尚未能明確NR4A2對乳腺癌細胞調控的具體分子機制。未來尚基于更多分子技術和手段，以確定NR4A2下游結合蛋白或直接調控分子。