假酸漿毛狀根黃酮提取工藝優化及其抑菌活性研究

張 帥，呂宏佳，李婧菲，趙 雪

(吉林農業科技學院生物工程學院，吉林 吉林 132101)

0 引言

假酸漿又名草本酸木瓜，為茄科一年生草本植物，廣泛栽培在我國云南、廣西等地[1-2]。其全草入藥，主要功效有解毒、清熱退火、吐痰止咳等，可治療發熱、熱淋、癲癇、瘡癤等疾病[3-4]。毛狀根是由完整的植物或由植物中某一部分受到發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)侵染后所產生的一種病理現象[5]，利用發根農桿菌誘導出來的毛狀根中所含的次生代謝產物和自然生長的植物中有相同之處，更有些被誘導出的毛狀根所含有的次生代謝物成分超過原植物[6]。

黃酮類化合物是植物的一種次級代謝產物，廣泛存在自然界中，常用作抗菌劑、抗氧化劑和感光劑等，具有抗老化、調血脂、降血壓等保健功能，已成為醫藥和食品中天然抗氧化劑的開發目標[7-8]。但目前對毛狀根中黃酮的提取率普遍不高，提高毛狀根中黃酮的提取率是進行黃酮產品開發需要解決的問題。近些年，細菌的耐藥性現象日益嚴重，黃酮作為天然產物之一，其抗菌性能也備受關注[9]。分析了假酸漿植物誘導出的毛狀根中黃酮類化合提取工藝的優化，并對其抑菌作用進行評價，為提取毛狀根中黃酮類化合物提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

假酸漿無菌苗，假酸漿毛狀根，發根農桿菌菌株A4。蘆丁標準品，Cef (頭孢噻肟鈉)溶液，氫氧化鈉，硝酸鋁，無水乙醇，98%濃硫酸，苯酚試劑，蒸餾水。

1.2 儀器設備

電熱恒溫培養箱BPX-272，光照培養箱SPX-300B-G，超聲儀器KQ-400KDE，立式雙層智能精密型搖床BSD-YX(F)3200，單人單面垂直凈化工作臺VS-840-1，電子天平BSA124S-cw，UV-5100型紫外可見分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 假酸漿毛狀根的誘導與培養

取假酸漿無菌苗在無菌環境中剪下其莖段(1 cm左右)放置于MS固體培養基上，預培養2 d。在無菌環境滅菌的錐形瓶中倒入活化好的發根農桿菌菌液，將預培養好的假酸漿莖段放置于菌液內，侵染6 min。取出被侵染的莖段，放置于無菌濾紙上，吸干表面上的菌液，將被侵染的莖段放置于MS固體培養基上，實行共培養4 d。將共培養好的莖段取出，放置于(含有50 mg/L青霉素)MS 固體培養基上培養，此后每 6 d 轉接一次，直至長出毛狀根后逐漸降低培養基中抗生素濃度進行培養，培養到25 d 時統計毛狀根數量，在無菌環境中建立毛狀根離體培養體系。

1.3.2 液體培養基的篩選

在無菌環境中，剪取0.2 g(鮮重)毛狀根，分別放入含有20 mLMS、White 和 N6(不含激素)的三種液體培養基中進行增殖培養，培養溫度設置為 25℃，搖床轉速設置為 170 r/min。避光培養，待生長6 d、12 d、18 d、24 d時測增殖數，篩選出最佳液體培養基。

增長倍數=(收獲后鮮重-接種鮮重)/接種鮮重。

1.3.3 提取毛狀根總黃酮含量

假酸漿毛狀根樣品的制備。將培養后的假酸漿毛狀根從液體培養基取出，用無菌水反復沖洗3次，后置于烘干箱低溫(40℃)烘干，用研缽將干燥的毛狀根研磨成粉末，密封保存備用。

毛狀根中黃酮的提取。準確稱取2 g研磨后的假酸漿毛狀根粉末，以乙醇為溶劑，采取超聲提取法(功率為220 W)提取毛狀根中的黃酮。

標準品溶液的制備。稱取3 mg蘆丁對照品置容量瓶中，加入濃度為70%乙醇30 mL進行溶解。以濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。

蘆丁標準品標準曲線的制備。用移液管分別吸取對照品溶液0.0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別放入10 mL容量瓶中，每個容量瓶內加入0.4 mL硝酸鈉、0.4 mL硝酸鋁和4 mL氫氧化鈉，用70%乙醇定容至刻度，混合搖勻，在510 nm波長處測定吸光度，根據測出的吸光度值繪制標準曲線。結果計算得標準回歸方程Y=2.822 9X-0.001 9，R2=0.999 1，在0.01～0.05 mg/mL內呈良好的線性關系，結果如圖1所示。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.4 單因素試驗

乙醇濃度對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取干燥的毛狀根粉末2.0 g，按1∶20料液比，用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇與毛狀根粉末混合作為提取液，提取溫度設置為50℃，超聲時間設置為30 min，超聲波功率設置為220 W，檢測黃酮提取率。

提取溫度對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取研磨后毛狀根粉末2.0 g，與70%乙醇溶液混勻，超聲功率220 W，料液比為1∶20，提取時間30 min，設置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的溫度進行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。

料液比對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取研磨后毛狀根粉末2.0 g，加入到裝有70%乙醇溶液的容量瓶中，超聲功率220 W，溫度60℃，時間40 min，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，進行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。

提取時間對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取毛狀根粉末2.0 g，與70%乙醇溶液混勻，220 W超聲功率、60℃提取溫度，1∶20料液比，時間分別采用10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min進行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。

1.3.5 假酸漿毛狀根中黃酮抑菌作用研究

超聲提取出的黃酮提取液稀釋成濃度分別為0.5 mg/mL、1.0 mg/m L、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的溶液備用。采用紙片擴散法，準確吸取0.1 mL在LB培養基中活化好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，將其分別接種在PDA培養皿中，用滅菌后的接菌針均勻涂布，密封后置于28℃恒溫培養箱內，培養48 h。以1%頭孢曲松鈉為陽性對照，分別放入直徑5.0 mm的無菌濾紙片浸泡，無菌水為陰性對照。將濾紙剪成直徑為1 cm左右的小圓片，放置到5種不同濃度的黃酮溶液中浸泡，小濾紙片全部吸上液體后取出，把小濾紙片放置到供試菌株培養基表面，取3個濾紙片置于每個培養皿中，分別為頭孢曲松鈉(陽性對照)、陰性對照液和供試液，記好標識，37℃培養箱中培養17 h，取出培養皿，測抑菌圈直徑，作好記錄。

2 結果與分析

2.1 毛狀根增殖液體培養基的篩選結果

由圖2可見，當毛狀根在MS液體培養基中生長，能促使其增殖量最多，其次培養基為N6，White培養基增殖量最少。當培養時間到24 d時，毛狀根的增殖量最多，最高增殖量為接種量23.7倍。

圖2 培養基對毛狀根生長的影響Fig.2 Effect of medium on the growth of hairy root

2.2 單因素對毛狀根中黃酮提取率的影響

2.2.1 乙醇濃度對毛狀根黃酮提取率的影響

如圖3所示，當乙醇濃度范圍在50%～90%時，毛狀根中黃酮提取率先是逐漸增加，當達到最高量后開始出現下降趨勢，提取率最佳狀態是乙醇濃度為70%時，測得毛狀根中黃酮得率為8.2%。

圖3 乙醇濃度對黃酮提取得率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction of flavones

2.2.2 提取溫度對毛狀根總黃酮提取率的影響

如圖4所示，超聲浸提毛狀根中黃酮量，伴隨著溫度升高，黃酮含量呈先增后減趨勢，提取溫度升高到60℃時，毛狀根中黃酮的提取率最高，毛狀根中黃酮得率為7.8%。

圖4 提取溫度對黃酮提取得率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of flavones

2.2.3 料液比對毛狀根中黃酮提取率的影響

由于乙醇是揮發性溶劑，溶劑量的增加使黃酮被稀釋，黃酮在溶劑揮發過程中遭受損失，反而提高了雜質成分的溶出。由圖5可知，隨著料液比例逐漸的增大，毛狀根中黃酮提取率呈現逐漸上升而后下降狀態，在料液比1∶20時，毛狀根中黃酮的提取率最高，毛狀根中黃酮得率為8.3%。

圖5 液料比對異黃酮提取得率的影響Fig.5 Effects of ratio of liquid to solid on extraction of flavones

2.2.4 提取時間對黃酮提取率的影響

黃酮提取率還與提取時間有很大關系，時間太短沒能將黃酮類化合物提取出來，時間過長則易溶出其他雜質。如圖6所示，毛狀根中黃酮得率隨著提取時間的增加而逐漸增高，當到達40 min后，呈現明顯下降趨勢，所以最佳提取時間為40 min。

圖6 制取時間對黃酮提取得率的影響Fig.6 Effects of preparation time on extraction yield of flavonoids

2.3 假酸漿毛狀根中黃酮的抑菌效果

如表1所示，毛狀根中提取出的黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，黃酮濃度在0.05%時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有起到作用；黃酮濃度在0.1%時，只對金黃色葡萄球菌起到抑菌作用；當黃酮濃度分別在1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL時，對以上兩種菌均有抑菌作用，且隨著黃酮的濃度增加，抑菌效果更明顯。

表1 不同濃度黃酮的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effects of different concentrations of flavones

3 結論

長期以來，人們不斷從植物中獲取大量的次生代謝產物應于醫藥衛生方面。在單因素試驗的基礎上，對使用由發根農桿菌誘導出的假酸漿毛狀根中總黃酮的提取工藝參數進行優化，結果表明，利用超聲提取假酸漿毛狀根總黃酮的最佳工藝條件為70%乙醇濃度，60℃提取溫度，1∶20料液比，15 s輻射時間，30 min提取時間。在此篩選出的條件下，假酸漿毛狀根中總黃酮的得率可達8.3%。

黃酮類化合物抑菌作用越來越引起人們的重視[10]。本工藝提取的黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑制作用，在試驗范圍內，黃酮濃度越大，抑菌作用效果越明顯，說明假酸漿毛狀根中黃酮是一種具有抑菌活性的物質，可作為一種天然的有機防腐劑。