VEGFR-3通過PI3K/AKT信號通路促進觸液神經元增殖的作用機制

胡 茜 顏海健

貴州醫科大學附屬醫院急診科，貴州貴陽 550000

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可致患者殘疾[1-3]。神經干細胞巢中的觸液神經元（cerebrospinal fluidcontacting neurons，CSF-CNs）的作用特殊，能通過釋放活性物質促進神經修復[4-6]。血管內皮生長因子受體-3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）是神經細胞生長的調節劑[7-9]，但機制有待探究。本實驗首次研究VEGFR-3 對CSF-CNs 體外增殖的影響，通過觀察VEGFR-3 對PI3K/AKT 信號通路的影響，探討其促進脊髓修復的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF 級C57 新生3 d 健康小鼠10 只，體重1.5～2.5 g，雌雄不限，雅培奶粉（雅培公司，美國）喂養，貴州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證SYXK（黔）2018-0001，實驗動物合格證NO.43072621 010022871，經貴州醫科大學實驗動物倫理委員會許可。DMEM 培養基、雷帕霉素、牛血清（武漢漢萬科技有限公司），VEGFR-3 質粒（上海博達有限公司），GAPDH、HRP 標記二抗、PI3K、VEGFR-3、AKT、p-AKT（上海碧云天生物有限公司，貨號分別為AF5201、A0208、ab32089、ab182651、ab179463、ab8805）。

1.2 研究方法

1.2.1 CSF-CNs 獲取及鑒定 C57 新生3 d 鼠取頸髓組織獲得CSF-CNs，采用神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）鑒定CSF-CNs；利用CSFCNs 特異標志物PKD2L1 進一步驗證，計算純度：CSFCNs 純度=PKD2L1 陽性細胞/DAPI 陽性細胞數[10]。實驗獨立重復3 次。

1.2.2 CSF-CNs 培養及分組處理 DMEM 培養液培養，隔日用含EDTA 的胰酶消化，當細胞密度達到80%，用胰蛋白酶進行消化傳代。取CSF-CNs 分為四組：①正常對照組，DMEM 培養基培養；②空載質粒對照組，培養基中加入空載質粒；③VEGFR-3 質粒組，加入質粒轉染稀釋液100 μg，Western blot 檢測正常對照組、空載質粒對照組和VEGFR-3 質粒組的VEG FR-3表達量，驗證轉染成功[11]，實驗獨立重復3 次；④抑制劑組，轉染成功的細胞加入10 μl PI3K/AKT 抑制劑LY294002，培養24 h。

1.2.3 神經球數目、直徑檢測 各組培養24 h 后，吹打神經球形成單細胞懸液，種植在24 孔板，每組3 個復孔。3 d 后，每組選擇4 個視野檢測神經球個數，選擇15 個神經球測量神經球平均直徑，各組重復測量5 次。實驗獨立重復3 次。

1.2.4 Western blot 檢測 PBS 液洗滌3 次，添加細胞裂解液。各組取等量蛋白行SDS-PAGE 電泳，轉PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。配制小鼠一抗VEGFR-3、PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH 抗體（濃度分別為1∶1000、1∶200、1∶200、1∶200、1∶1000），一抗4℃孵育過夜；洗滌后，山羊抗小鼠IgG 1∶1000 室溫孵育1 h，TBST 液洗滌，壓片、照相，Image Pro Plus 7.0 進行圖片分析。實驗獨立重復5 次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CSF-CNs 培養及鑒定

流式細胞分選獲得CSF-CNs，用NSE 進行鑒定，見圖1。檢測標志物PKD2L1 抗體，其純度為（90.1±1.1）%，確認為CSF-CNs，見圖2（封三）。

圖2 PKD2L1 免疫熒光鑒定CSF-CNs（n=3）（見內文第24 頁）

2.2 轉染效果

48 h 的VEGFR-3 質粒轉染效率最高，見圖3A。與正常對照組、空載質粒對照組比較，VEGFR-3 質粒組VEGFR-3 表達量增加，差異有統計學意義（P ＜0.05），見圖3B。

圖3 VEGFR-3 質粒轉染效果（n=3）

2.3 VEGFR-3 過表達促進CSF-CNs 增殖

正常對照組與空載質粒對照組神經球計數比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；與空載質粒對照組、抑制劑組比較，VEGFR-3 質粒組神經球的計數比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組神經球計數比較（，n=3）

表1 各組神經球計數比較（，n=3）

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與空載質粒對照組比較，bP ＜0.05；與抑制劑組比較，cP ＜0.05。VEGFR-3：血管內皮生長因子受體-3

2.4 各組PI3K、AKT 及p-AKT 表達水平比較

正常對照組與空載質粒對照組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；與空載質粒對照組、抑制劑組比較，VEGFR-3質粒組PI3K、AKT及p-AKT表達升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 各組PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達水平（n=5）

3 討論

SCI 可進一步破壞脊髓組織，引起腦脊液變化[12-17]。CSF-CNs 可以與腦脊液、脊髓實質接觸，將脊髓實質和腦脊液有效聯系在一起，在SCI 修復中有重要作用[18-20]。

本研究利用C57 新生小鼠分離CSF-CNs，將其培養成神經球并觀察其增殖情況，驗證了CSF-CNs具有神經干細胞屬性。此外，本研究還進一步證實CSF-CNs 能特異表達VEGFR-3，并且VEGFR-3 可以通過調控PI3K/AKT 信號通路促進CSF-CNs 增殖。本研究猜測CSF-CNs 在AKT 信號激活后作用于脊髓實質，促進脊髓修復。

VEGFR-3 與特異性配體VEGF-C 結合可激活多種信號[21-22]，誘導細胞增殖[23-25]。其中PI3K/AKT 信號通路介導絲裂原依賴性生長和存活，是重要的信號轉導通路，該通路的激活可明顯抑制SCI 引起的細胞凋亡[26-28]。

綜上所述，在CSF-CNs 中VEGFR-3 可以調控PI3K/AKT 通路促進細胞增殖，LY294002 能阻斷該通路抑制CSF-CNs 增殖。