新疆柳樹葉銹病柵銹菌的形態學特征及系統學分析

王麗麗,李克梅,王金銘,努爾斯曼姑麗艾海提,田呈明

(1.北京林業大學/省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室,北京100083;2.新疆農業大學 農學院/農林有害生物監測與安全防控重點實驗室,烏魯木齊830052)

柳樹是重要的用材和造林綠化樹種,作為快速生長的木本主要生物質來源,在生態修復、裝飾材料、纖維生產等方面應用廣泛。新疆柳樹資源豐富,約有50種(變種)分布于高山、平原、河岸、沙丘、極地等多種生境,甚至有些種是耐旱、寒以及鹽堿等抗逆性強的種類[1]。

柳樹葉銹病發生于葉部,是一類危害柳樹健康生長的重要生物災害之一。柳樹整株染病后,會在正常秋葉脫落前六周或更長的時間內大量提前落葉,易導致樹勢衰弱而誘發其他病蟲害,尤其是對苗期及幼樹危害更大,降低成活率[1],造成經濟損失。

柳樹葉銹病病原種類較多,均屬擔子菌門(Basidiomycota)、銹菌目(Pucciniales)、柵銹菌科(Melampsoraceae)、柵銹菌屬(MelampsoraCast)。柵銹菌大都屬于專性寄生,與寄主關系密切,除少數種同主寄生于大戟科(Euphorbiaceae)、亞麻科(Linaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、夾竹桃科(Apocynaceae)和金絲桃科(Hypericaceae)外,多數柵銹菌種為轉主寄生,即夏孢子和冬孢子階段生于楊柳科(Salicaceae),而性孢子和銹孢子階段寄生于冷杉屬(Abies)、蔥屬(Allium)、衛矛屬(Euonymus)、落葉松屬(Larix)、紅門蘭屬(Orchis)、茶藨子屬(Ribes)、虎耳草屬(Saxifraga)、堇菜屬(Viola)等植物上[1-2]。

迄今為止,國內外已報道柵銹菌屬內有效種約100種,其中,超過50種寄生于楊柳科植物,而寄生于該科內柳屬(Salix)的柵銹菌數量最多,約40余種,國內34種[2-10]。在新疆,經傳統形態分類學研究報道了4種柳屬柵銹菌[8]。近十年,Zhao等[6-7]采用DNA內部轉錄間隔(ITS)、大亞基(LSU)等的分子系統發育研究與形態學相結合,對國內柳屬柵銹菌進行深入研究,并報道來自新疆柳屬的柵銹菌新種、國內新記錄種和新疆新記錄種各1種。筆者在2020年報道新種和新疆新記錄種各1種[9]。在傳統柵銹菌分類中以冬孢子形態、夏孢子形態、寄主與轉主寄主種類作為主要鑒定依據,然而,冬孢子有時在種間差異不明顯,有時甚至不產生,反而是夏孢子產生并存活時間最長。目前,許多國內外學者研究柵銹菌分類發現,夏孢子形狀、表面刺突、側絲特征在種間具有明顯差異,常被用于分種的主要依據,促使柵銹菌分類體系得到進一步補充完善。

筆者近幾年在新疆各地廣泛采集銹菌標本時發現,本地區柳樹葉銹病普遍發生,其病原柵銹菌種類、寄主范圍、分布地點都較以往有所不同。本文利用現代真菌分類學技術,對新疆柳屬葉銹病柵銹菌物種、寄主及分布開展研究,為新疆菌物分類及多樣性研究提供標本和基礎數據,為林木病害診斷與防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2012—2016年,于新疆維吾爾自治區阿勒泰、塔城、伊犁、烏魯木齊、昌吉、阿克蘇、庫爾勒、和田等地州,山地、平原、牧場、河岸、荒漠、農田及城市綠化地等生境采集柳屬葉銹病標本,標本保存于新疆農業大學菌物標本室(HMAAC)。

1.2 形態學觀察及系統發育分析

1.2.1 形態學觀察 利用實體顯微鏡、光學顯微鏡和掃描電鏡對柵銹菌夏孢子及冬孢子階段的形態特征進行拍照、測量及描述,顯微鏡檢以乳酚油作浮載劑[10]。夏孢子階段特征觀察:夏孢子堆葉面著生位置,夏孢子形態、大小、壁厚度、表面是否具有光滑區、刺間距、芽孔的數量及位置,側絲形狀、大小、壁厚度、著生位置。冬孢子階段特征觀察:冬孢子堆葉面著生位置,冬孢子著生位置,冬孢子形狀、大小、壁厚度。

1.2.2 分子系統發育分析 DNA提取主要參考玻片研磨法[11];選用ITS和LSU兩個基因片段進行系統發育分析,二者擴增引物為ITS1F和ITS4、NL1和NL4[12]。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,于4℃保存。從最新文獻和GenBank中篩選已知柳屬柵銹菌和外群落葉松楊柵銹菌(M.laricis-populina)的基因序列,利用RaxmlGUI1.3軟件的最大似然法(ML)和MrBayes v.3.1.2軟件的貝葉斯分析(BI)構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 種類鑒定及檢索表

經對45份柳屬柵銹菌標本進行主要形態特征研究(圖1、表1),共鑒定出9種柵銹菌,其中,米黃柳柵銹菌(M.asalicis-michelsonii)為國內外首次發現的種,在菌名前標識##符號,表示為新種;為新疆首次發現的有3種,扁桃柵銹菌(M.amygdalinae)、云南柳柵銹菌(M.salicis-cavaleriei)和中國黃花柳柵銹菌(M.salicis-sinicae),標識#符號,表示為新疆銹菌新記錄種。其余5種均為新疆已知種,北極柵銹菌(M.arctica)、伊朗柵銹菌(M.iranica)、松柳柵銹菌(M.larici-epitea)、白柳柵銹菌(M.salicis-albae)、銀柳柵銹菌(M.salicis-argyraceae)。寄主范圍共涉及柳屬內14種,其中,藍葉柳(S.capusii)等8種在國內外報道的柳屬柵銹菌寄主范圍內屬首次出現,其名稱前標識*符號,表示為該銹菌的寄主新記錄(表2)。

表1 新疆柳屬葉銹柵銹菌的夏、冬孢子堆階段形態特征Table1 Uredinia and telia morphological characteristics of Melampsora species on Salix in Xinjiang

表2 新疆柳屬葉銹柵銹菌的寄主范圍及分布Table2 Hosts and distribution of Melam psora species on Salix in Xinjiang

本文對9種新疆柳樹柵銹菌制定平行式形態分類檢索表,以供相關病原種類鑒定研究參考。檢索表如下。

1.夏孢子通常為長橢圓形至卵形 …………2

1.夏孢子通常為球形、卵形至寬橢圓形…4

2.夏孢子堆僅葉正面生…………………………………………#M.salicis-cavaleriei

2.夏孢子堆葉背面生或葉兩面生 …………3

3.單主寄生,夏孢子堆葉背面生,極少葉正面生……………………………#M.amygdalinae

3.轉主寄生,夏孢子堆葉兩面生,葉背面生為主………………………………M.salicis-albae

4.冬孢子角質層下生或表皮層及角質層下生,夏孢子堆葉背面生 ……#M.salicis-sinicae

4.冬孢子表皮層下生 ………………………5

5.夏孢子堆葉兩面生 ………………………6

5.夏孢子堆葉背面生 ………………………8

6.夏孢子堆葉正面生為主 ……M.iranica

6.夏孢子堆葉背面生為主 …………………7

7.冬孢子堆葉兩面生,葉正面生為主…………………………##M.salicis-michelsonii

7.冬孢子堆葉兩面生,葉背面生為主……………………………………………M.arctica

8.冬孢子頂端不增厚 ……M.larici-epitea

8.冬孢子頂端增厚…………………………………………………M.salicis-argyraceae

2.2 系統發育分析

本次系統發育研究獲得ITS和LSU序列長度約分別為560 bp和570 bp,經構建ML和貝葉斯系統發育樹,二者相對應的拓撲結構以及分析結果一致(圖2)。M.amygdalinae(支持率98/0.96)、M.iranica(79/0.85)、M.larici-epitea(88/0.93)、M.salicis-albae(99/1)和M.salicis-argyraceae(88/0.98)分別與相應已知種具有較密切的親緣關系而聚于同一分支,這5種柵銹菌的形態學鑒定與系統發育分析結果具有一致性,充分說明ITS和LSU序列信息在其種間具有明顯差異。

但在系統發育樹頂端M.arctica、M.salicissinicae和M.abietis-caprearum卻匯聚在一起,就形態特征而言,它們都具有形態極為相似的夏孢子,即個體均較小,為球形或寬橢圓形,這可能是三者在系統發育樹上處于同一類群的主要原因。但M.arctica夏孢子堆可葉兩面生,以葉背面生為主,而M.salicis-sinicae和M.abietis-caprearum夏孢子堆僅在葉背面生。此外,M.arctica冬孢子大小為55～60×17～24μm,頂端未增厚[2-3],M.salicis-sinicae冬孢子為39～86×10～26μm,較長而窄,頂端增厚[4],而M.abietis-caprearum冬孢子偏狹小為19～30×9～12 μm,頂端不增厚[2],特此區分為3個種。由此說明ITS和LSU基因信息在這3種之間的種間差異過小無法區分,需通過結合形態學差異來區別。此外,在系統發育樹中,M.salicis-cavaleriei和M.salicis-michelsonii均未與任何已知種匯合,而是分別形成的獨立分支,說明二者均為獨立的種,結合比較形態特征的差異,后者已作為新種被發表[9]。前者的相關報道極少,唯一模式標本因難以提取DNA至今僅有形態描述[10,23],但依據文獻,M.salicis-cavaleriei是所有已知柳屬柵銹菌中唯一夏孢子堆僅葉正面生的物種。本研究中該標本的夏孢子堆恰是僅葉正面著生,此外,夏孢子、側絲和冬孢子的形態均與該已知種形態描述一致,特此鑒定為本種。

3 討論與結論

3.1 新疆柳屬葉銹病柵銹菌物種組成

本研究從14種柳屬植物葉部共發現9種柵銹菌,包括1個新種M.salicis-michelsonii和3個新疆新記錄種M.amygdalinae、M.saliciscavaleriei和M.salicis-sinicae,M.salicis-argyraceae等5種新疆已知種。其中,M.salicis-cavaleriei、M.salicis-sinicae、M.salicis-michelsonii和M.salicis-argyraceae均只分布于中國,為中國特有種,且后二者在國內僅分布于新疆,又為新疆特有種[4,7,9-10]。

M.amygdalinae是柳屬上唯一報道的單主寄生柵銹菌[2],本研究采集該種標本時僅形成夏孢子階段,因此,已結束的性孢子和銹孢子以及還未形成的冬孢子階段均未能見到。M.saliciscavaleriei為中國云南特有種,本次研究發現該種在新疆也有分布,經系統發育研究后,首次報道了該種的ITS和LSU片段核酸信息。

據新疆柳屬葉銹病柵銹菌以往的報道,還有個別種在本次研究中未發現,如M.capraearum、M.epitea和M.ribesii-viminalis[10],原因在 于本次標本采集地還不足夠廣泛,在今后的研究工作中,還有待于擴大調查繼續補充。至此,新疆柳屬葉銹病柵銹菌的種類共有12種,充分體現新疆銹菌物種具有豐富的多樣性。

3.2 新疆柳屬葉銹病柵銹菌寄主范圍特點

在寄主植物種類及數量方面,文獻報道M.arctica和M.larici-epitea廣泛分布國內外,其寄主范圍較廣。在本研究中,二者侵染柳樹種類較多,分別為4種、各占本次寄主種類總數的29%,亦體現其寄主范圍較廣。2014年報道的新種M.salicis-sinicae相關文獻少,在本次研究中可侵染5種不同柳樹,占比達到36%,體現該種寄主范圍較廣。M.salicis-albae為世界廣布種,但從文獻與本研究結果(標本數量10份)發現,該種只侵染S.alba一種寄主,寄主范圍單一說明該菌專性寄生性較強。其次,寄主S.argyracea(9份)和(8份)均可被3種不同柵銹菌侵染,二者和S.alba的標本數量共占標本總數的60%,是最易被柵銹菌侵染的柳屬樹種。此外,研究結果發現,有8種柳屬植物新增為銹菌寄主新記錄,大大擴增了柵銹菌寄主范圍。本文因缺少柵銹菌性孢子器和銹孢子器寄生的標本,未能對其轉主寄主進行相關研究,還有待日后完善,僅在文中提供文獻記載的相關信息以供參考(表3)。

表3 新疆柳屬葉銹柵銹菌的性、銹孢子器階段形態特征Table3 Spermogonia and aecia morphological characteristics of Melampsora species on leave of Salix

3.3 新疆柳屬葉銹病柵銹菌地理分布特點

就地理分布及生境而言,本研究柳屬柵銹菌在山地、平原、牧場、河岸、荒漠、農田及城市綠化地等多個生境均有不同分布。其中,分布于沙漠的物種最少,僅M.salicis-michelsonii(1份)為典型荒漠真菌;分布于山地物種最多,M.salicissinicae(14份)、M.salicis-argyraceae(4份)、M.iranica(2份)和M.salicis-cavaleriei(2份)分布于天山,M.amygdalinae(1份)分布于阿爾泰山,共5種23份標本合占本次研究總柵銹菌物種數和標本數的一半,可見山地是其優勢分布生境。

本文只是柳屬葉銹病柵銹菌一階段性報道,科研工作者還需要更多、更深入的野外調查以及采用更先進的分類技術去探索新疆菌物多樣性,相信還有許多未知物種或類群有待被發現。

致 謝:承蒙新疆農業大學草環學院周桂玲教授和林園學院王兵副教授在寄主植物鑒定方面給予的幫助,在此表示誠摯的感謝!