基于轉錄組測序分析牛不同脂肪組織的脂肪沉積差異研究

王思元,劉 迪,張偉紅,王國富,高樹新

(1.內蒙古民族大學 動物科技學院,內蒙古通遼 028000;2.內蒙古通遼市開魯縣獸醫局,內蒙古通遼 028000)

脂肪組織是一個活躍的代謝器官,該組織對于脂質積累、能量消耗、葡萄糖和胰島素代謝以及激素調節至關重要,對維持全身能量穩態具有深遠的作用[1]。脂肪組織的發育和積累程度受多種因素的調節,包括飲食、年齡、品種以及脂肪組織類型等,同時脂肪代謝也是一個受多途徑、多基因共同調控的復雜過程[2]。目前已發現眾多參與脂肪代謝的分子,例如:脂肪酸結合蛋白4(Fatty Acid Binding Protein4,FABP4)、脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,FASN)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)、CCAAT增 強 子 結 合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)和甾醇調節元件結合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1,SREBP1)等,他們都在調節脂肪細胞分化沉積的過程中發揮重要作用[3-6]。

脂肪組織按部位主要分為內臟脂肪和皮下脂肪,這2種脂肪組織在表型結構、代謝途徑和脂質積累上都有明顯的差異[7]。有研究表明,與皮下脂肪相比,內臟脂肪細胞的脂質周轉率更高[8],成熟脂肪細胞比例更高,前體脂肪細胞分化能力較弱;同時,內臟脂肪中雄性激素受體更多且對β-腎上腺素敏感[9],其具有更強的脂解代謝活性、胰島素抵抗性以及攝取葡萄糖能力,而皮下脂肪吸收循環中的游離脂肪酸和甘油三酯(Triacylglyceride,TAG)的能力較強[10]。在肉牛養殖業中,最重要的就是低成本生產優質肉,而內臟脂肪的沉積會降低牛肉品質并引發多種代謝疾病[11]。因此,了解肉牛不同脂肪組織的脂質代謝差異的機制,有助于提高肉牛業的生產效率。

目前,轉錄組測序技術被廣泛應用于功能基因的挖掘和利用,可以加快對基因的系統性理解[12]。本試驗采用高通量RNA-Seq(RNA Sequencing)技術,以安格斯牛(Aberdeen Angus)和西門塔爾牛(Simmental cattle)為模型,研究不同部位脂肪組織(背皮下脂肪和腎周脂肪)的轉錄組圖譜,發掘與脂肪沉積相關的功能基因,以期為深入研究皮下脂肪和內臟脂肪的差異提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 試驗所需的安格斯牛和西門塔爾牛由內蒙古自治區通遼余糧畜業開發有限公司提供。選取相同月齡且體質量差異不顯著的西門塔爾牛和安格斯牛各3頭,屠宰后,采集每頭牛相同部位的腎周脂肪和背皮下脂肪,立即將所有樣品投入液氮,并在-80℃條件下保存,直至隨后使用。

1.1.2 主要試劑 Trizol、反轉錄試劑盒(KR118)和Talent熒光定量檢測試劑盒SYBR Green(FP209-01)均購自天根(北京)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和轉錄組測序 使用Trizol提取不同脂肪組織中的總RNA。使用Nanodrop(Thermo,美國)檢測總RNA樣品的純度(D260/D280)和濃度。樣品檢測合格后,由深圳華大基因生物科技有限公司完成測序,使用平臺為BGISEQ-500。

1.2.2 測序數據處理與注釋 將測序所得的原始數據(Raw data),過濾掉低質量、接頭及未知堿基含量過高的reads后,獲得高質量的Clean Data,然后利用HISAT軟件將Clean Data與牛的參考基因進行對比。其次利用String Tie軟件進行轉錄本重構,并使用Cuffcompare挑選出新的轉錄本,使用CPC對新轉錄本進行蛋白編碼潛力預測,隨后將預測具有蛋白編碼潛力的新轉錄本加入到參考基因中,得到一個完整的參考轉錄本。最后使用Bowtie2將clean reads比對到參考序列以統計基因比對率,并利用RSEM計算基因和轉錄本的表達水平,使用FPKM作為基因表達水平的衡量指標。

1.2.3 基因表達分析 在所有樣本中均檢測到的基因稱為共基因。使用OmicShare在線工具(www.omicshare.com/tools),基于log2FPKM值生成了一個熱圖,該熱圖顯示了表達量最高的共同基因。

使用DEGseq方法確定安格斯、西門塔爾牛,腎周脂肪和背皮下脂肪樣品組間的差異表達基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)。以q-value(校正后的p-value)≤0.001和差異倍數(|log2(Foldchang-e)|＞1)2個水平作為篩選標準。

1.2.4 差異基因分析 用基因本體(Gene Ontology,GO)來分析DE基因的功能。將DEG與基因本體數據庫(http://www.geneontology.org/)進行比對,對計算出的P值進行校正,將校正后的P值≤0.05作為所有DE基因GO項的閾值?；谕返姆治鲇兄诶斫釪E基因在某些生物學過程中的特定功能。將DEG與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數據庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進行比對,Q值≤0.05的途徑被認為DE基因顯著富集。

1.2.5 實時熒光定量PCR驗證差異基因表達使用Trizol提取西門塔爾牛和安格斯牛的腎周脂肪和背皮下脂肪總RNA,然后利用反轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板,對差異基因進行實時熒光定量PCR驗證。PCR反應體系:2×Talent qPCRPre Mix 10μL,正 反 向 引 物(10 μmol/L)各0.6μL,ROX Reference Dye(50×)2μL,cDNA模 板1.25μL,dd H2O 5.55μL。PCR反 應 程 序:95℃預 變 性3 min;95℃變 性5 s,57℃退火10 s,72℃延伸15 s,40個循環。以β-actin為內參基因,每個樣品進行3次技術重復。引物由Primer(6.0)設計并由上海生工生物技術服務有限公司合成(表1),用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

表1 引物信息Table1 Primer information

2 結果與分析

2.1 測序數據分析

使用BGISEQ-500平臺檢測安格斯牛、西門塔爾牛的腎周脂肪和背皮下脂肪共12個樣品,每個樣品平均產出10.99 Gb數據。Q20、Q30是指測序過程中,對所識別的堿基給出的錯誤概率。Q20代表錯誤識別的概率是1%,即正確率是99%;Q30則代表錯誤識別的概率是0.1%,即正確率是99.9%。由表2可知,各樣品clean reads Q30(過濾后的reads中質量值大于30的堿基數占總堿基數的比例)百分比均在88.2%以上,滿足后續分析要求。通過對原始數據進行整理,樣品比對基因組的平均比對率為92.32%,同時樣品間比對率較均勻,樣品之間的數據具有可比性;共檢測到23 472個基因,其中已知的基因為22 582個,預測的新基因為933個;共檢測出19 747個新轉錄本,其中15 643個屬于已知蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型,933個屬于新的蛋白編碼基因的轉錄本,剩下的3 171個屬于長鏈非編碼RNA。

表2 過濾后的reads質量統計Table2 Quality statistics of filtered reads

2.2 共同高表達基因

為了進一步研究脂肪組織中特定基因的表達模式,在每個樣本的前100個高表達基因中篩選出50個共同基因,并根據FPKM值將它們分為3個主要簇(圖1)。第一組由32個基因組成,主要是編碼核糖體蛋白或核糖體蛋白同源物的基因。而與脂肪沉積有關的幾個基因,即脂肪酸結合蛋白4(Fatty Acid Binding Protein4,FABP4),脂肪形成調節因子(Adipogenesis Regulatory Factor,ADIRF)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(Stearoyl-Co A Desaturase,SCD),與其他基因一起組成第二組和第三組。在熱圖中,不同的顏色代表不同的表達水平。紅色代表較高的表達,綠色代表較低的表達。在第一組和第二組中,所有基因在2個脂肪組織之間均表現出相似的差異表達模式。特別是在腎周脂肪中,核糖體蛋白基因和2個脂肪沉積相關基因(FABP4、ADIRF)的表達比在背皮下脂肪中更高。第三組的大多數基因在背皮下脂肪中的表達水平高于腎周脂肪。在所有測試的脂肪組織中,SCD的m RNA表達水平最高。

2.3 差異表達基因的篩選

為了全面了解腎周脂肪和背皮下脂肪組織中DEGs,選擇安格斯牛和西門塔爾牛2個不同品種牛進行分析。使用q-value值≤0.001和|log2Foldchang-e|＞1的篩選標準篩選DEGs。在安格斯牛腎周和皮下脂肪中,發現731個上調基因和947個下調基因;在西門塔爾牛腎周和皮下脂肪中,發現1 193個上調基因和762個下調基因(圖2)。

2.4 差異表達基因的分析

根據細胞成分,分子功能和生物學過程,對DEGs進行GO功能分類,結果顯示,安格斯牛、西門塔爾牛2個脂肪組織間的差異基因,在生物過程中,富集最多的是細胞過程和單細胞生物過程,代謝過程次之;細胞組分中,細胞和細胞部分富集最多,其次是膜和膜部分;分子功能中,主要是結合和催化活性(圖3和圖4)。

為了確定與脂肪沉積有關的生物學途徑,將DEGs對比到KEGG數據庫中,認為Q值≤0.05的途徑是顯著富集的。在安格斯牛腎周脂肪和皮下脂肪中發現與脂質代謝有關的幾種途徑,PPAR信號通路(21個基因,Q=0.007 745 447 6)、甘油脂代謝(14個基因,Q=0.001 507 545)、類固醇生物合成(7個基因,Q=0.002 561 65)、甘油磷脂代謝(17個基因,Q=0.009 139 934)和ECM-受體相互作用(37個基因,Q=0.007 264 252 3)等途徑得到了顯著富集。

在西門塔爾牛2種脂肪組織中,顯著富集的途徑包含PPAR信號通路(16個基因,Q=0.044 426 68),甘油脂代謝(12個基因,Q=0.033 519),胰島素分泌(19個基因,Q=0.002 077 858),脂肪細胞脂解作用的調控(15個基因,Q=0.001 166 248)和ECM-受體相互作用(44個基因,Q=0.000 009 415 021),這些途徑可能有助于脂肪沉積或脂肪酸代謝。

在所有比較中,PPAR信號途徑、甘油脂代謝和ECM-受體相互作用是富集豐富的共同途徑。因此,將重點放在這3個途徑以進行下一步的研究。表3列出在3種途徑中富集的DEG。在PPAR信號傳導途徑和甘油脂代謝中,發現9個表達差異較大且共同的DEGs,包括3個上調基因:視黃酸X受體α(retinoid X receptor alpha,RXRA)、C1q腫瘤壞死因子相關蛋白7(C1q and TNF related 7,C1QTNF7)、單酰甘油-O-?；D移酶2(Monoacylglycerol O-acyltransferase 2,MOGAT2)和6個下調基因:肉堿脂酰轉移酶1B(Carnitine Palmitoyltransferase 1B,CPT1B)、解偶聯蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)、脂肪酸結合蛋白3(Fatty Acid Binding Protein 3,FABP3)、脂肪酸轉位酶(Fatty Acid Translocation enzyme,CD36)、脂蛋白1(LPIN1)、甘油-3-磷酸?；D移酶3(Glycerol-3-phosphate Acyltransferase 3,GPAT3)。在ECM-受體相互作用中,Ⅰ型膠原Α(Collagen Type I alpha 1 Chain,COL1A1)、III型膠原Α1(Collagen Type III alpha 1 Chain,COL3A1)、膠原Α2(Collagen Type I alpha 2 Chain,COL1A2)和II型膠原Α1(Collagen Type II alpha 1 Chain,COL2A1)在背皮下脂肪中上調,而層粘連蛋白γ3(Laminin Subunit gamma 3,LAMC3)和粘連蛋白γ2(Laminin Subunit gamma 2,LAMC2)的表達量下調(表4)。

表3 富集在PPAR通路、甘油脂代謝和ECM-受體相互作用的差異表達基因Table3 Differentially expressed genes enriched in PPAR pathway,glycerol metabolism and ECM-receptor interaction

表4 富集在PPAR通路、甘油脂代謝和ECM-受體相互作用的共同差異表達基因Table4 Common differentially expressed genes enriched in PPAR pathway,glycerol metabolism and ECM-receptor interaction

2.5 實時熒光定量PCR驗證

為驗證轉錄組的準確性,對差異表達基因COL1A1、COL3A1、RXRA、LPIN1和GPAT 3進行實時熒光定量PCR驗證。圖5結果顯示,實時熒光定量PCR分析結果與轉錄組測序數據基本一致。

3 討論

脂肪代謝的機制是很復雜的,在肉牛養殖業中操縱脂肪沉積來生產優質牛肉非常重要。本研究以安格斯牛和西門塔爾牛為模型,通過轉錄組測序和生物信息學分析,篩選出不同脂肪組織與脂肪沉積相關的高表達共基因和差異基因,探討了差異形成的可能分子機制。

3.1 牛脂肪沉積的高表達候選基因

此次研究中,發現3個脂肪沉積的候選基因,即FABP4、ADIRF和SCD,它們在牛的脂肪組織中大量表達。FABP4是一種脂肪細胞特異性的脂肪酸結合蛋白,與脂肪酸有很高的親和力,被認為在動物的脂肪酸運輸和脂肪沉積中發揮作用[13]。研究證實,FABP4參與牛的脂肪積累,且其多態性與牛羊肉的嫩度有關[14]。ADIRF特異性分布于細胞核,在脂肪組織高度表達,在人類肥胖者的脂肪組織中該基因表達量顯著上調。Ni等[15]研究發現,在3T3-L1細胞中過表達ADIRF基因可上調PPARγ和C/EBPα的水平,并在脂肪形成的早期促進成脂分化;此外,還可刺激前體脂肪增殖并抑制凋亡,同時通過增加葡萄糖轉運蛋白4(Facilitated Glucose Transporter 4,GLUT4)的表達水平,增強了脂肪細胞的葡萄糖攝取能力[16]。表明,ADIRF可以調節脂肪細胞增殖分化和葡萄糖轉運,促進脂肪沉積。但目前,對于該基因的研究十分有限,且僅局限于人類,其在家畜中的功能特性需要進一步發掘。SCD是催化飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉化的關鍵酶,其表達量和活性與脂肪沉積和單不飽和脂肪酸含量呈正相關[13],可以通過調節脂肪沉積和脂肪酸組成來改善肉質。Am等[17]研究

顯示,SCD是脂肪生成轉錄因子SREBP-1C的靶基因,并在UTR區域受SREBP-1C正調控,SCD基因的敲除會顯著降低SREBP-1C的表達水平,并抑制前體脂肪的分化[18]。有報道稱,油酸可激活SCD敲除小鼠中SREBP-1C的表達和活性[19]。表明,SCD作為油酸生物合成的關鍵酶,其可能通過調控油酸的合成來影響SREBP-1C的表達與活性,并進一步調節其他脂肪生成基因,最終影響脂肪生成。

3.2 幾種差異基因對脂肪沉積的影響

在本研究中,發現在牛的背皮下脂肪和腎周脂肪中差異化表達PPAR信號通路和甘油酯代謝通路中的多個基因(表4),其中RXRA、C1QTNF7和MOGAT2在背皮下脂肪中被上調。RXRA屬于配體依賴性核受體家族成員,RXRA可作為一個有活性的配體結合亞單位與PPARs形成異二聚體作用于靶基因[20]。當PPARγ與RXRA進行異二聚化才能產生活化的核受體結構,并與靶基因啟動子上的過氧化物酶體增殖物反應原件(Peroxisome Proliferator Response Element,PPRE)結合,從而調控靶基因的表達[21];同時Xue等[22]的研究發現,PPARA/RXRA信號可調節綿羊肝臟中脂肪酸的代謝。表明,RXRA的表達與活性能調節PPARs生物功能的發揮,進而影響脂肪的代謝。C1QTNF7與脂聯素具有高度結構相似性,主要在脂肪組織中表達[13]。肥胖人的循環和肝臟中C1QTNF7水平顯著升高,并且與體質量指數、葡萄糖、胰島素和TAG水平呈正相關[23]。體內試驗表明,與野生型小鼠(Ferox genus murium)相比,C1QTNF7敲除小鼠會減弱肥胖所引起的胰島素抵抗,改善葡萄糖代謝和脂肪組織炎癥[23]。以上結果表明,C1QTNF7基因的表達可能會對脂肪代謝有著重要的作用。MOGAT2是?；视王；D移酶家族的關鍵成員,能催化甘油一酯的酯化生成甘油二酯,該基因的缺失會使得機體食物攝入和脂肪吸收減少,增加能量消耗,并減輕由飲食誘導的葡萄糖耐受不良和脂肪積累[24]。

在腎 周 脂 肪 中CPT1B、LPIN1、GPAT3和CD36基因表達水平上調。CPT1B是脂肪分解代謝的關鍵酶,也是脂肪酸β-氧化的限速酶,催化脂酰輔酶A與肉毒堿結合生成脂酰肉堿,并將其轉移到線粒體內膜進行β-氧化,從而為機體提供能量并減少脂肪沉積。CPT1B在腎周脂肪中的表達量上調,可能是內臟脂肪脂解代謝活性強于皮下脂肪的部分原因。但目前,CPT1B對脂肪沉積的調控頗有爭議,俞雨陽等[25]研究顯示,綿羊肌肉組織中的CPT1B基因的表達量與肌間脂肪沉積量呈顯著正相關,而Zhao等[26]以豬為研究對象發現,CPT1B表達量與肌間脂肪呈負相關;高明[27]發現在牛胎兒成纖維細胞中隨著CPT1B的表達量升高,TAG的含量呈現顯著上升的趨勢,而Zhang等[28]在前體脂肪細胞中則顯示CPT1B的高表達量會抑制TAG的生成。推測這些差異可能與種間特異性以及組織間特異性有關,CPT1B在脂肪代謝中的具體功能及作用機制需要進一步研究。LPIN1是脂類家族成員,在維持脂質代謝穩態中起關鍵作用,一方面LPIN1是催化磷脂酸轉化為TAG和磷脂所必需的磷脂酸磷酸酶,另一方面,其可以與PPARα和PPARγ共激活劑α(PGC-1α)作用,共同調節脂肪分化和脂類合成等過程[29]。GPAT是TAG從頭合成途徑中的限速酶,可催化TAG合成的第一步,將3-磷酸甘油轉化為溶血磷脂酸(LPA),具有四種亞型GPAT1-4。其中GPAT3定位于內質網,最重要的是GPAT3被認為是脂肪細胞中合成TAG的主要亞型[30]。在前脂肪細胞中發現,GPAT3m RNA的表達量在分化過程中顯著上調;另外,過表達GPAT3后,胞內的TAG含量顯著增加(約3～4倍),而敲低該基因,幾乎完全阻止了脂滴的形成[31],表明GPAT3對脂質的形成有促進作用。體內試驗顯示,與野生型小鼠相比,高脂飲食飼喂的GPAT3敲除小鼠能減少脂肪的沉積,改善葡萄糖和脂質代謝,減輕胰島素抵抗[32]。CD36對長鏈脂肪酸具有高親和力,其高表達有助于組織對脂肪酸的吸收,可促進脂質在組織中的積累。此外大量研究證實,CD36可以介導其他信號通路,造成機體的代謝紊亂,并引發一系列疾病,如:胰島素抵抗、II型糖尿病和炎癥反應等[33-34]。本 試 驗 中LPIN1、CPAT3和CD36在牛腎周脂肪中上調表達,表明LPIN1、CPAT3和CD36可能是促進內臟脂肪含量增加,進而引發代謝性疾病的候選基因。

UCP1和FABP3在2個 脂 肪 組 織 間 的 表 達量也不同。UCP1在棕色脂肪脂肪中發現,在生熱和脂解調節中起關鍵作用[35]。研究表明,UCP1的多態性與奶牛的乳品質[36]和綿羊的胴體性狀[37]有關。FABP3與FABP4具有相似的功能,主要在心臟和骨骼肌中表達,調節肌肉脂肪含量和脂肪組織發育。

3.3 細胞外基質在脂肪組織中的作用

在脂肪組織中,脂肪細胞嵌入在細胞外基質(ECM)網絡中,該網絡可以支持和錨固脂肪細胞并調節脂肪生成,主要由膠原蛋白組成[38]。不同的膠原蛋白構成不同的成分,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原形成原纖維,Ⅳ型膠原形成基膜。在脂肪細胞分化早期,Ⅰ、Ⅲ型膠原由前體脂肪細胞分泌,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原在分化的中期達到峰值[13]。在本研究中,ECM途徑相關的基因,如:COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1和其他基因的差異表達,顯示了在牛腎周脂肪和背皮下脂肪間ECM結構和成脂能力的差異。

4 結論

本研究提供牛2個不同脂肪組織的轉錄圖譜,鑒定出高度轉錄的共同基因,并利用GO和KEGG數據庫分析了腎周脂肪和背皮下脂肪之間的差異基因。數據顯示FABP4、ADIRF和SCD與脂肪沉積相關,并有很高的轉錄水平。9個與脂肪沉積相關的基因(RXRA、C1QTNF7、MOGAT2、CPT1B、LPIN1、GPAT3、UCP1、FABP3和CD36)和6個ECM相 關 基 因(COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、LAMC2和LAMC3)可能是造成腎周脂肪與背皮下脂肪之間脂肪代謝差異的候選基因。需要進一步研究候選基因在脂肪代謝中的作用,以改善肉牛的育種過程。