意大利蜜蜂amPGI基因的克隆與表達分析

歐陽霞輝,徐文凱,鄭相相,彭 帥,劉麗霞

(西北民族大學 生命科學與工程學院,蘭州 730030)

葡萄糖-6-磷酸異構酶(Glucose-6-phosphate isomerase,PGI)普遍存在于真核生物和原核生物中,是參與糖酵解途徑的一種重要的多功能酶,主要通過轉移碳位上的質子催化葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸的相互轉換[1]。PGI根據行使功能的不同,又稱神經細胞素(Neuroleukin,NLK)、自分泌運動因子(Autocrine mobility factor,AMF)和分化成熟調節因子(Differentation and maturation mediator,DMM)[2-3]。PGI作為一種非常保守的酶[4],不僅參與糖代謝,還在動物細胞中作為自分泌運動因子,促進腫瘤細胞增殖浸潤,從而調節細胞分裂和生長因子活性[5-6]。由于PGI在生物體內行使多種功能,所以該酶的基因缺陷可引起多種疾病[7]。

自首次從兔肌肉中分離PGI以來,有關PGI的研究報道逐漸增加,研究對象廣泛,如人類、魚類、植物及微生物等[8]。有關哺乳動物PGI的研究報道顯示,PGI與胚胎細胞和癌細胞的細胞增殖密切相關。Kugler等[9]研究發現PGI基因缺失會導致老鼠胚胎死亡。趙亮[10]研究證實PGI在白血病細胞中高表達,下調PGI基因后可抑制糖酵解途徑并引發細胞凋亡。王芬等[11]干擾PGI在乳腺癌MCF-7細胞中的表達后,MCF-7細胞的糖代謝和細胞增殖被抑制,從而加快細胞凋亡。在昆蟲中,對果蠅和桔小實蠅的初步研究發現,PGI是一種重要的糖酵解酶,參與昆蟲生長發育過程中的能量代謝[12],同時還是幾丁質生物合成途徑中的關鍵酶之一[13-14],在幾丁質的形成中起重要作用[15]。

盡管國內外學者對PGI已經作了比較詳盡的研究,但有關昆蟲PGI基因的研究報道依然較少,對昆蟲PGI的了解有限,仍有很多問題尚待解決。本研究以重要的經濟昆蟲—意大利蜜蜂(Apis mellifera)為研究對象,對其PGI基因進行克隆和分析,并進一步檢測該基因在意大利蜜蜂不同品級不同發育階段的表達譜,明確該基因的分子結構特征和表達模式,以期為進一步闡明am PGI在意大利蜜蜂生長與發育過程中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 取樣 意大利蜜蜂采自甘肅省蘭州市五泉王氏養蜂場,采樣如下:工蜂取第2天的卵(G-2),第3天孵化期幼蟲(G-3),幼蟲期第5、7、9、11天的幼蟲(G-5、G-7、G-9、G-11),蛹期的預蛹(GY)、白眼蛹(G-B)、紅眼蛹(G-H),羽化成蟲(GC);雄蜂取第2天的卵(X-2),第3天孵化期幼蟲(X-3),幼蟲期第4、6、8、10、12天的幼蟲(X-4、X-6、X-8、X-10、X-12),蛹期的預蛹(X-Y)、白眼蛹(X-B)、紅眼蛹(X-H),羽化成蟲(X-C);蜂王取第2天的卵(W-2),第3天孵化期幼蟲(W-3),幼蟲期第4、5、6、7天的幼蟲(W-4、W-5、W-6、W-7),蛹期的預蛹(W-Y)、白眼蛹(W-B)、紅眼蛹(WH),羽化成蟲(W-C)。

1.1.2 試劑 Trizol購自Invitrogen公司;反轉錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker、克隆載體p MD18-T、大腸桿菌DH5α感受態細胞、TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)均購自大連寶生物工程公司;膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自索萊寶(北京)有限公司;引物合成和DNA序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;其他化學試劑均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 采用Trizol法提取80～110 mg組織樣品總RNA[16]。采用分光光度計測定RNA樣品的濃度及OD260nm/280nm值,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA質量。用反轉錄試劑盒PrimeScriptRTMaster Mix(Perfect Real Time)將總RNA反轉錄為c DNA,于-20℃保存。

1.2.2 引物設計及擴增 根據GenBank中PGI已有同源序列(XM_623549.6),利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1),以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為:上、下游引物各0.2μL,EXTaq酶5μL,模板0.5μL,最后用dd H2O補足至10μL。PCR反應程序為:95℃預變性5 min,98℃變性10 s,50℃退火30 s,72℃延伸2 min 30 s,共30個循環,72℃延伸10 min,4℃保存。經瓊脂糖凝膠鑒定的目的片段利用膠回收試劑盒回收,且與p MD18-T載體連接,轉化至E.coliDH5α,接種于LB平板培養基上培養后,挑斑、搖菌,經PCR擴增驗證目的基因的片段大小,提取重組質粒p MD18-T-amPGI,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測定,將正確的序列提交至GenBank。

1.2.3 序列分析 采用ORF finder搜索開放閱讀框,翻譯成氨基酸序列。采用DNAStar進行序列同源性比對,通過MEGA 5.0軟件基于NJ法 構 建 系 統 進 化 樹。采 用Protparam和ProtScale分析amPGI的理化性質及親疏水性;利用SOPMA和SWISS-MODEL預測amPGI結構。采用Interpro預測amPGI的保守結構域;利用Motif Scan在線程序預測翻譯后修飾位點。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析意大利蜜蜂PGI表達模式 以意大利蜜蜂β-actin(登陸號:NM_001185146.1)為內參基因[17](引物序列見表1),使用Line Gene9660 qPCR儀進行RT-qPCR檢測。以意大利蜜蜂不同品級不同時期樣品的cDNA為模板,每個樣品設3個重復。實時熒光定量PCR反 應 體 系(20μL)為:TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)(2×)10 μL,上下引物各0.8μL,c DNA 2μL,RNase Free H2O 6.4μL;反應程序為:95℃預變性1 min,95℃變性10 s,60℃退火30 s,40個循環。采用2-△△Ct法進行基因相對表達量計算[18],應用SPSS 21進行單因素方差分析和多重比較,并利用GraphPad Prism 7軟件繪圖。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

2 結果與分析

2.1 amPGI基因的克隆

經RT-PCR擴增,最終獲得一條1 674 bp的目的條帶(圖1),經克隆測序、比對鑒定,確定是意大利蜜蜂PGI基因序列,命名為amPGI,將序列提交GenBank,登錄號為MK713970。該序列包含一個1 674 bp的開放閱讀框,編碼一個由577個氨基酸組成的蛋白質。

2.2 amPGI同源性分析與系統進化樹構建

序列比對發現,意大利蜜蜂與大蜜蜂Apis dorsata(XP_006610643.1)、小蜜蜂Apis florea(XP_003690758.1)、美洲東部熊蜂Bombus impatiens(XP_003490330.1)、歐洲雄蜂Bombus terrestris(XP_003396233.1)、苜蓿切葉蜂Megachile rotundata(XP_003701061.1)、印度跳蟻Harpegnathos saltator(XP_011142877.1)、紅火蟻Solenopsis invicta(XP_025997003.1)、小火蟻Wasmannia auropunctata(XP_011696577.1)、茶翅蝽Halyomorpha halys(XP_014282603.1)的PGI的氨基酸序列相似度分別為96.3%、96.0%、90.1%、90.1%、85.7%、82.4%、80.3%、79.9%、62.5%,可見意大利蜜蜂amPGI與大蜜蜂PGI的序列相似度最高(圖2)。

基于NJ法對已報道的昆蟲PGI序列進行系統發育分析,結果顯示,意大利蜜蜂與大蜜蜂的親緣關系最近,并與其他幾種蜜蜂聚成一個大類,與茶翅蝽的關系比較遠,這與序列比對的結果和物種的實際進化歷程相符,說明PGI在進化過程中非常保守(圖3)。

2.3 amPGI氨基酸序列理化特性、親疏水性預測與分析

Protparam分析結果顯示,amPGI分子質量為62.97 ku,等電點(PI)為7.73,不穩定指數為27.32,半衰期為30 h,同時含有57個負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)和58個正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys),為偏堿性的穩定蛋白。amPGI蛋白含有20種標準氨基酸,亮氨酸(Leu)含量最多(11.0%),半胱氨酸(Cys)含量最低,僅占0.7%。

ProtScale的分析結果表明,amPGI蛋白為親水蛋白,且第324位的丙氨酸疏水性最強(Max=2.756),第445位的谷氨酸親水性最強(Min=-2.767)(圖4)。

2.4 amPGI蛋白結構功能預測與分析

2.4.1 結構預測與分析 使用在線軟件SOPMA預測意大利蜜蜂amPGI蛋白的二級結構,其中α-螺旋(Alpha helix)占47.76%、β-轉角(Beta turn)占6.82%、延伸鏈(Extended strand)占14.00%、無規卷曲(Random coil)占31.42%。利用SWISS-MODEL在線軟件基于PDB數據庫對amPGI進行同源建模(模板為4wmj.1.A),獲得amPGI蛋白三級結構模型(圖5)。由三級結構可知,α-螺旋占主導地位,與二級結構預測結果一致。

2.4.2 保守結構域預測與分析 利用Ex PASy的inter Pro在線程序預測意大利蜜蜂amPGI蛋白的保守結構域,結果顯示該蛋白屬于糖磷酸異構酶家族,為葡萄糖-6-磷酸異構酶,有2個保守結構域,其結構域位點分別為127～289、337～528,表明該蛋白在生物進化過程中高度保守。同時含有10個催化核心的活性位點(圖5),氨基酸位置分別為161I、163G、164S、213S、214K、215T、218T、275G、357Q、361E。

2.4.3 翻譯后修飾位點預測與分析 Motif Scan分析特定位點結果顯示:amPGI含有5個N-糖基化位點;1個c AMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點;4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點;7個N-豆蔻酰化位點;4個蛋白激酶C磷酸化位點。

2.5 amPGI實時熒光定量PCR

amPGI基因在意大利蜜蜂不同品級、不同發育時期均有表達,且差異顯著(P＜0.05)。在工蜂發育的各個時期中(圖6-A),卵前期和蛹期該基因表達量較低,幼蟲期5日齡其表達量最高,從卵期2日齡到幼蟲期5日齡和從蛹期到成蟲期其表達量逐漸增加。在雄蜂發育的各個時期中(圖6-B),卵期和蛹期該基因表達量較低,成蟲期其表達量最高,從卵期2日齡到幼蟲期4日齡和從紅眼蛹期到成蟲期其表達量逐漸增加。在蜂王發育的各個時期中(圖6-C),卵前期和蛹期該基因表達量較低,幼蟲期6日齡其表達量最高,從卵期2日齡到卵期3日齡其表達量逐漸增加,且幼蟲期4日齡與卵期3日齡其表達量無差異,同時從蛹期到成蟲期其表達量也逐漸增加。

意大利蜜蜂不同品級、不同發育時期該基因表達情況對比分析結果表明(圖7),不同品級從卵期到幼蟲期第1天(卵的孵化階段)、從蛹期到成蟲期(蛹的羽化階段)該基因表達量都急劇增加。此外,不同品級卵前期和蛹期該基因表達量相對穩定。

3 討論

PGI既催化糖代謝,又參與幾丁質(也稱甲殼素)合成,其中糖代謝提供機體所需的大量能量,幾丁質則在昆蟲外骨骼的形成中發揮著重要作用[15,19-20]。PGI是由單一基因位點編碼的關鍵蛋白酶,該基因缺失或功能異常會導致機體死亡,如該基因缺失可導致老鼠胚胎死亡[9]。目前對PGI的研究主要集中于高等動物、魚類、植物以及微生物[21],而在蜜蜂等昆蟲類動物中還鮮有報道。

在桔小實蠅中,PGI基因高表達于脂肪體和馬氏管[15],而脂肪體是昆蟲中大分子有機物(糖類、蛋白類)代謝的關鍵位置[22],另外發現,PGI還是節肢動物中一種重要的適應性分子標記[23]。本研究克隆得到意大利蜜蜂am PGI基因,其編碼區全長1 674 bp,編碼557個氨基酸,且amPGI與大蜜蜂的親緣關系最近,序列相似度達到96.3%。半衰期越長蛋白結構越穩定,不穩定指數小于40為穩定蛋白[24],且α-螺旋和β-轉角化學鍵鍵能較高,不易變性,能夠維持蛋白的高級結構,意大利蜜蜂amPGI蛋白半衰期為30 h,不穩定指數小于40,同時α-螺旋和β-轉角總占比達54.58%,說明amPGI是一種穩定蛋白。已知蛋白質翻譯后修飾有400多種[25],是調節蛋白質結構功能的重要方式[26],其中磷酸化和去磷酸化過程調控著細胞的增殖分化和新陳代謝[27],am PGI存在9個磷酸化位點,同時保守結構域發揮著重要作用,是蛋白的核心,2個保守結構域內包含10個催化核心的活性位點,且161I、163G、164S、213S和214K處在疏水區域的分子內部,說明其在意大利蜜蜂的發育過程中可能與細胞增殖分化的能量代謝有關。

為進一步探討amPGI在意大利蜜蜂生長發育過程中的生物學功能,檢測并分析該基因在意大利蜜蜂不同品級、不同發育時期的表達情況。幼蟲期和成蟲期是昆蟲運動、營養轉化和快速發育的關鍵階段,且有研究發現果蠅幼蟲的生長依賴于一種類似哺乳動物瓦氏效應的有氧糖酵解形式[12],意大利蜜蜂不同品級、不同發育時期的幼蟲期和成蟲期該基因表達量大體上都比卵前期和蛹期高,推測這兩個階段利用糖酵解途徑合成所需的大量能量,這與陳力[15]研究結果頗為相似。此外,桔小實蠅不同發育時期PGI基因的表達與幾丁質含量變化具有顯著線性相關性[15],推測其利用幾丁質合成途徑合成生長發育所需的幾丁質。不同發育時期轉變時細胞活力會迅速增強[28],對ATP、氨基酸和核苷酸等大分子物質需求量增加,從而會提高糖酵解和幾丁質合成速率,不同品級卵的孵化和蛹的羽化過程中該基因表達量都急劇增加,以適應機體生長發育過程中的代謝需求。

工蜂屬于生殖器官發育不完善的雌性,相比雄蜂和蜂王,工蜂成蟲中amPGI可能主要參與幾丁質的合成。工蜂發育的各個時期中成蟲期該基因表達量較高,但明顯低于雄蜂和蜂王成蟲期的表達。雄性原始生殖細胞的增殖、精子的超活化以及精卵結合都受益于糖酵解[29],且抑制糖酵解及其相關蛋白酶的活性會影響雄性原始生殖細胞的增殖,并導致精子功能異常[30-31],在雄蜂發育的各個時期中成蟲期該基因高表達,推測糖酵解在雄蜂精巢的成熟過程中發揮著重要作用。卵母細胞可吸收來自于卵丘細胞糖酵解產生的丙酮酸,并以此作為能量物質促進卵母細胞的分裂和卵子的形成[32-33],且體外培養的高表達糖酵解相關酶的卵子質量更佳[34],在蜂王發育的各個時期中成蟲期該基因表達量與雄蜂成蟲期相當,由此可知am PGI基因在蜂王卵巢及卵子的發育過程中具有重要作用。

本研究預測分析amPGI蛋白的理化性質及生物學功能,同時檢測并分析am PGI基因在意大利蜜蜂不同品級、不同發育時期的表達情況,以期為進一步闡明amPGI在意大利蜜蜂生長與發育過程中的功能奠定基礎,為糖酵解、幾丁質合成等相關通路的研究提供理論依據。