塔里木裂腹魚人工繁殖、胚胎發育和早期仔魚發育研究

趙年樺,徐 筱,趙 賀,溫子政,劉茂春,胡仁云,聶竹蘭

(1.塔里木大學 動物科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室,新疆阿拉爾 843300;3.塔里木珍稀魚類研究中心,新疆阿拉爾 843300;4.武漢中科瑞華生態科技股份有限公司,武漢 430000)

塔里木裂腹魚(Schizothorax bid dulphi)隸屬于鯉形目(Cypriniformes),鯉科(Cyprinidae),裂腹魚亞科(Schizothoracinae),裂腹魚屬(Schizothorax),是新疆的特種魚類,因此被漁民稱為“新疆魚”,目前僅分布于新疆維吾爾自治區塔里木河水系,是塔里木河流域最具代表性的魚類之一[1]。20世紀50年代,其種群數量曾在博斯騰湖達到最大值,占漁獲物組成的80%,一度成為該湖最重要的經濟魚類之一[2]。20世紀70年代前后,塔里木裂腹魚由于自身條件的限制,例如生長力度緩慢、性成熟晚、繁殖力低下以及對產卵場所和生活條件要求較高等,再加上人為條件和自然環境的約束,例如興修水庫、開墾荒地等,導致塔里木裂腹魚的生存棲息地遭到嚴重迫害,因而種質資源和數量急劇減少[3],現博斯騰湖已無該魚種,僅在塔里木河水系的渭干河、阿克蘇河、和田河、克孜勒河、車爾臣河、葉爾羌河中存留,且數量極少。塔里木裂腹魚在1998年作為新疆二級保護野生動物被收錄于《中國瀕危動物紅皮書》[4],2004年被新疆維吾爾自治區列為II類水生保護動物,是中國特有的重要的珍稀魚類之一[5]。

對瀕危魚類進行人工繁育與增殖放流,是保護該魚類免遭滅絕的重要措施。此前,張人銘等[6]對新疆阿克蘇河(Aksu River)的塔里木裂腹魚進行人工繁殖試驗,并其胚胎發育進行描述,龔小玲等[7]對新疆車爾臣河(Qarqan River)的塔里木裂腹魚的胚胎和1～22 d仔魚發育進行描述,二者均未對塔里木裂腹魚出膜方式以及人工催產藥物劑量進行研究。本試驗于2020年將新疆克孜勒河(Kizil River)捕撈的野生塔里木裂腹魚作為親本,探究最佳人工催產藥物濃度并對其胚胎發育和1～36 d仔魚生長進行詳細觀察,進一步豐富塔里木裂腹魚早期生活史,為其保護及增殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點及親魚來源

繁殖用塔里木裂腹魚親魚于2018年1-12月、2019年1-12月捕自克孜勒河流域,共捕獲野生親本1 365尾,其中體長為159.33～245.29 mm,體質量為65.34～170.02 g。試驗于2020年4-6月在新疆察汗烏蘇魚類增殖站進行,選擇雄性塔里木裂腹魚親魚為3+以上,雌性塔里木裂腹魚親魚為4+以上,雌雄親魚比例1∶2,養殖于循環水養殖池中(規格≥20 m3水深≥0.8 m、溶氧≥5 mg/L),期間投喂斯特徍生物活性飼料T2、T3,日投餌率為3%～5%。

1.2 人工催產

試驗用魚為健康雌魚,共計960尾。采用顯著性檢驗和響應面法,探究鯉魚腦垂體(Pituitary gland,PG)、馬來酸地歐酮(Domperidone,DOM)和促黃體素釋放激素A2(Luteinizing hormone releasing hormone A2,LRH-A2)對塔里木裂腹魚催產效果的單項調控和復合項調控作用。以PG、DOM、LRH-A2為催產劑,參照厚唇裂腹魚(Schizothorax irregularis)[8]和細鱗裂腹魚(Schizothorax chongi)[9]催產藥物所需藥量,設置各催產劑用量梯度。其中PG用量梯度為5、10、15、20和25 mg/kg;DOM用量梯度為5、10、15、20和25 mg/kg;LRH-A2用量梯度為10、15、20、25和30μg/kg。每個單項調控試驗中設置3個試驗組,每組10尾雌魚。進行3種催產藥物復合項調控試驗時,采用3因素1水平的Box-Benhnken試驗設計,因子水平分別為-1、0、1,試驗點共17個,每個試驗點共設置3組重復試驗,每10尾雌魚。通過試驗結果分析建立塔里木裂腹魚催產率(Y)與PG(A)、DOM(B)和LRH-A2(C)因素間的多元線性回歸方程。

所有雌魚進行催產時均采用胸鰭基部注射2針法,第1針注射總量的1/5,間隔12 h后,將剩下的4/5藥量全部進行注射。整個試驗用水為經過循環系統過濾的地下水,水溫為(16.5±0.5)℃,p H為8.45～8.56,溶解氧為3.5～3.7 mg/L,鹽 度 為0.17%～0.19%,氨 氮＜0.1 mg/L。

1.3 人工授精及孵化

采用干法進行授精。將受精卵均勻鋪放在孵化框中(0.50 m×0.40 m×0.35 m),并放入孵化池中(5.00 m×0.45 m×0.50 m),采用淋浴式孵化法[8]進行孵化,水溫變化控制在16.0～16.5℃,溶解≥8.0 mg/m L。

1.4 胚胎發育和早期仔魚發育觀察

選取同批次50粒受精卵進行胚胎發育觀察研究,利用SMZ 1270數碼體式顯微鏡觀察受精卵發育各時期,以70%的受精卵進入相同發育時期作為一個發育期的判定;選取同批次受精卵發育出膜的仔魚用于早期仔魚發育觀察研究,每次選取至少10條仔魚,采用10%福爾馬林溶液固定,在鏡下進行觀察記錄并參照龔小玲等[7]劃分仔魚發育時期的方法進行塔里木裂腹魚仔魚發育時期的確定。

1.5 孵化效率評價

根據下列公式,計算塔里木裂腹魚催產率、受精率和孵化率。

催產率=產卵尾數/催情總尾數×100%

受精率=原腸中期活卵數/產卵總數×100%

孵化率=魚苗水花尾數/受精卵總數×100%

1.6 數據處理

卵徑及各發育階段的仔魚全長的數據以“平均數±標準差”來表示。探究催產劑對塔里木裂腹魚催產效果的單項調控和復合項調控作用時,其催產率結果使用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析,采用Duncan’s法進行多重比較,顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 對塔里木裂腹魚催產率的單獨調控結果

圖1所示,在5～25 mg/kg PG用量區段間,塔里木裂腹魚催產率隨著用量上升而出現先增加后減少的趨勢,在PG用量為10 mg/kg條件下,催產率達到最高,為(26.67±0.06)%;同樣,在5～25 mg/kg DOM用量區段間,塔里木裂腹魚催產率隨著用量上升而同樣出現先增加后減少的趨勢,在DOM用量為15 mg/kg條件下,催產率達到最高,為(26.67±0.15)%;圖2所示,當LHR-A2用量為25μg/kg時,塔里木裂腹魚催產率達到最高,為(23.33±0.06)%。

2.2 最佳催產藥物濃度篩選

響應面試驗設計方案及結果見表1。塔里木裂腹魚催產率(Y)與PG(A)、DOM(B)和LRHA2(C)因素間的多元線性回歸方程為Y=-29.42A2-36.08B2-24.42C2-4.17AB+7.50AC+4.17BC-8.33A+1.67B-2.50C+78.00。回歸模型決定系數R2為0.993 5,校正系數R2Adj為0.985 2,表明試驗誤差較小;模擬失效項P為0.568 4(P＞0.05),且根據PG、DOM和LRH-A23種因素對塔里木裂腹魚催產率調控的響應面結果顯示,PG和DOM、PG和LRHA2、DOM和LRH-A2對響應值(Y)的交互作用均呈開口向下的山丘狀,二維等高線近圓形(圖3),說明模型有效,可以很好分析和預測三種催產藥物對塔里木裂腹魚催產率的效果。本試驗響應模型的優化結果顯示,PG在13.47 mg/kg、DOM在15.27 mg/kg和LRH-A2在19.28μg/kg,此時塔里木裂腹魚催產率理論值最高,為78.75%。經過驗證,最優催產藥物濃度下塔里木裂腹魚催產率為(76.67±0.06)%,結果與理論催產率基本相符,說明響應模型方程可有效預測塔里木裂腹魚催產率。

表1 響應面試驗方案及結果(±s)Table1 Response surface design and results

表1 響應面試驗方案及結果(±s)Table1 Response surface design and results

試驗組Group編碼值Code value(mg/kg)B-DOM/(mg/kg)C-LRH-A 2/(μg/kg)A-PG/催產率/%Induced spawning rate 1 1(25) 0(15) 1(30) 20.00±0.10 2 0(15) 0(15) 0(20) 73.33±0.06 3 0(15) 0(15) 0(20) 76.67±0.06 4 -1(5) 1(25) 0(20) 26.67±0.06 5 0(15) 1(25) 1(30) 23.33±0.06 6 0(15) 1(25) -1(10) 16.67±0.06 7 1(25) 1(25) 0(20) 0.00±0.00 8 0(15) 0(15) 0(20) 76.67±0.06 9 0(15) -1(5) 1(30) 10.00±0.10 10 1(25) -1(5) 1(20) 6.67±0.06 11 -1(5) 0(15) 1(30) 20.00±0.10 12 1(25) 0(15) -1(10) 13.33±0.06 13 0(15) 0(15) 0(20) 83.33±0.06 14 0(15) 0(15) 0(20) 80.00±0.10 15 -1(5) -1(5) 0(20) 16.67±0.06 16 0(15) -1(5) -1(10) 20.00±0.00 17 -1(5) 0(15) -1(10) 43.33±0.11

2.3 塔里木裂腹魚胚胎發育

胚胎發育包括早期胚胎發育(受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原腸胚、神經胚期、胚孔閉合期)以及器官發生(肌節出現期、眼囊期、耳囊期、尾芽期、肌肉效應期、心跳期、出膜期)共14個時期(圖4),在水溫19～19.2℃條件下,歷時93 h 36 min發育為仔魚,總積溫為1 785.24℃·h(表2)。

2.4 塔里木裂腹魚早期仔魚發育

魚苗出膜進入仔魚期,仔魚出膜4 d后進入平游期。本試驗對1～36 d仔魚發育進行觀察,將對1～36 d仔魚發育劃分為以下幾個時期。

2.4.1 卵黃囊期(1～6 d齡) 1 d仔魚體透明,全身無色素,體長為(7.21±0.16)mm(圖5-1 d);2 d仔魚眼球色素出現(圖5-2 d);3 d仔魚消化道貫通(圖5-2 d);4 d仔魚開始平游,眼球色素明顯加深(圖5-4 d);6 d仔魚卵黃囊體積明顯縮小,背部出現黑色素(圖5-6 d)。

2.4.2 彎曲前期(7～17 d齡) 7 d仔魚卵黃囊被吸收完全,鰾充氣膨大,尾鰭條開始出現(圖5-7 d);11 d仔魚身體前部、中部、尾部均可見黑色素分布(圖5-11 d);17 d仔魚腸道前端開始彎曲(圖5-17 d)。

2.4.3 彎曲期(18～26 d齡) 18 d仔魚背鰭褶縮小,脊椎向上彎曲形成鰾前室(圖5-18 d);19 d仔魚出現背鰭條,臀鰭褶縮小形成獨立臀鰭,尾鰭開始分叉(圖5-19 d);26 d仔魚尾鰭叉形明顯(圖5-26 d)。

2.4.4 彎曲后期(27～36 d齡) 27 d仔魚尾鰭叉形逐漸加深(圖5-27 d);31 d仔魚背鰭與臀鰭全部形成(圖5-31 d);34 d仔魚腹鰭條開始出現(圖5-34 d);36 d仔魚腹鰭形成完全,尾下骨與脊索完全垂直,此時仔魚全長為(19.42±0.87)mm(圖5-36 d)。

2.5 塔里木裂腹魚人工繁殖試驗結果

2020年4月23日至6月3日在察汗烏蘇魚類增殖放流站催產塔里木裂腹魚親魚44組,進行5批次塔里木裂腹魚人工繁殖試驗,如表3所示,共獲取成熟卵粒25.08萬粒,平均催產率為59.09%,平均受精率為68.78%,平均孵化率86.37%,獲水花魚苗14.9萬尾。

表3 塔里木裂腹魚人工繁殖試驗Table3 Artificial propagation test of S.biddulphi

3 討論

3.1 人工催產

對野生珍稀魚類進行人工馴養和繁殖是保護瀕危物種的重要手段,但大多數野生魚類在人工飼養時,不能順利實現自我繁衍[10]。在人工調控的環境條件下,對魚類注射人工合成激素,是實現魚類繁殖和人工助產的有效途徑之一[11-12]。魚類人工催產時的效率受魚的品種、催產藥物種類及劑量和水溫等因素的影響,合適的催產藥物種類及劑量可以有效提高催產率[13-14]。本試驗中塔里木裂腹魚催產藥物種類及劑量與拉薩裂腹魚(Schizothorax waltoni)[LRH-A2(10μg/kg)+DOM(10 mg/kg)][14]、昆明裂腹魚(Schizothorax grahami)[LRH-A2(220μg/kg)+HCG(1 500 IU/kg)+DOM(10 mg/kg)][15]、重口裂腹魚[Schizothorax(Racoma)davidi][RH-A2(10μg/kg)+DOM(2 mg/kg)][16]、四川裂腹魚(Schizothorax kozlovi)[LRH-A2(15μg/kg)+PG(5 mg/kg)+HCG(1 500 IU/kg)][17]、雙須葉須魚(Ptychobarbus dipogon)[RH-A2(6μg/kg)+PG(3 mg/kg)][18]等裂腹魚亞科魚類差別較大,催產水溫在裂腹魚亞科魚類中屬于較高水平。推測由于魚的種類、所用催產藥物及劑量、水溫不同,造成魚類催產效率也各不相同。如何有效提高裂腹魚亞科魚類人工催產效率,有待進一步研究。

在實際生產中,催產素的綜合使用是提高塔里木裂腹魚產卵率的有效方法,根據親魚的發育情況,可以選擇1～2次注射。發育較好的親魚可以進行1次注射,發育較差的親魚和初產魚則必須進行2次注射[12]。塔里木裂腹魚親本催產前,需投喂高蛋白餌料以保證親魚的強化培育。催產后,親魚有時會因應激反應過強而死亡,所以在生產過程中,需要將催產后的塔里木裂腹魚盡快放入高溶氧的養殖池中,等其體質恢復后,再放入土池塘中進行飼養。塔里木裂腹魚為國家瀕危保護魚類,野外種質資源十分稀少,人工繁殖又需要進行野外引種,這將對野生種群造成極大破壞。因此,有效提高親魚的催產率和產后成活率,對塔里木裂腹魚的保護具有重大意義。

3.2 不同河流中塔里木裂腹魚的胚胎發育差異

將克孜勒河塔里木裂腹魚與阿克蘇河[6]、車爾臣河[7]塔里木裂腹魚胚胎發育進行比較(表5):三者卵徑、初孵仔魚長度、卵黃消失時間相近,說明三個地理的塔里木裂腹魚種群繁殖性狀較為相似;克孜勒河和車爾臣河塔里木裂腹魚胚胎發育歷時相近,而阿克蘇河塔里木裂腹魚胚胎發育歷時較長,為101.9 h;克孜勒河塔里木裂腹魚出膜時前已經形成心臟、胸鰭原基和血液循環,而車爾臣河群體出膜前僅出現肌肉效應,阿克蘇河群體出膜前只出現心臟搏動,三個地理種群胚盤發育歷時和出膜時發育階段不同。克孜勒河塔里木裂腹魚人工孵化水溫較高,始終維持在19～19.2℃,而車爾臣河塔里木裂腹魚孵化最低水溫為16℃,阿克蘇河塔里木裂腹魚孵化最低水溫為14℃,推測可能孵化水溫不同,造成了不同地理群體胚胎發育時間和出膜時發育階段的存在差異。

溫度是影響魚類生殖的關鍵因素之一[19-20]。水溫調控性腺發育成熟具有完整的機制:適宜的溫度可以促使魚類的下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(Gn RH),激發垂體分泌促性腺激素(GTH)作用于性腺,性腺接受信號后分泌性類固醇激素,誘導性腺發育成熟并排出卵子或精子[21-22]。當水溫過高或者過低時,該機制的啟動會受到極大的影響,導致人工催產效率下降,魚類也會因此出現排卵困難或難產的情況[23]。本研究驗證最優催產藥物濃度時,于(16.5±0.5)℃水溫條件下催產率則達到(76.67±0.06)%,推測塔里木裂腹魚在16℃左右的水溫條件下,對外源激素敏感性上升,性腺加快成熟,人工催產效率提高,親魚更容易排出卵子或精子。探索塔里木裂腹魚人工催產所需的最適水溫,是提高人工繁殖效率的關鍵。

3.3 塔里木裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的胚胎發育差異

將塔里木裂腹魚與厚唇裂腹魚(S.irregularis)[8]、齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)[24]、重口裂腹魚[S.(Racoma)davidi][25]、異齒裂腹魚(Schizothorax oconnori)[26]、扁吻魚(Aspiorhynchus laticeps)[27]等其他裂腹魚亞科魚類胚胎發育進行比較:由于裂腹魚亞科是棲息在高海拔和低溫水域環境中的冷水性魚類,其繁殖生育水溫也相對較低,所以裂腹魚亞科魚類胚胎發育溫度較低,均未超過22℃[8,24-27];塔里木裂腹魚胚胎發育用時最短,可能魚類品種不同可能造成了胚胎發育用時存在差異;塔里木裂腹魚的受精卵卵徑在幾種裂腹魚亞科魚類屬于較小類型,較小卵徑在一定程度上縮短了塔里木裂腹魚孵化時間,加快塔里木裂腹魚發育為仔魚的速度,有利于其更早適應外界環境[28-29]。出膜階段時塔里木裂腹魚、齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)和扁吻魚(Aspiorhynchus laticeps)處于血液循環器,厚唇裂腹魚處于胸鰭原基期,重口裂腹魚處于心臟搏動期,異齒裂腹魚(Schizothorax oconnori)處于心臟原基期。塔里木裂腹魚在胚胎發育的過程中心臟、胸鰭原基及血液循環均在孵化出膜前形成,這有利于其仔魚更好地適應外界環境[30]。塔里木裂腹魚、厚唇裂腹魚和重口裂腹魚都是尾部先出膜,齊口裂腹魚、異齒裂腹魚和扁吻魚出膜方式均為頭部或尾部出膜,筆者推測出膜方式可能與魚類品種有關。

3.4 塔里木裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的仔魚發育差異

塔里木裂腹魚初孵仔魚最短,推測塔里木裂腹魚初孵仔魚在裂腹魚亞科中屬小型。較小體型可以靈活游動,進入巖石等狹縫躲避捕食者獵食[31-32];塔里木裂腹魚仔魚出膜后7 d后卵黃囊消耗殆盡,時間較短。卵黃囊營養吸收較快,有利于魚體迅速生長和新陳代謝,促進仔魚器官分化和運動[33]。塔里木裂腹魚在卵黃囊消失前消化道完全貫通,7 d后,仔魚口、鰓和尾鰭快速發育,孵化后36 d,塔里木裂腹魚各鰭已基本長成,進入幼魚階段。關于塔里木裂腹魚卵黃囊確切機制有待于進一步研究。