獨活寄生湯治療大鼠膝骨關節炎的作用機制研究

陳俊，鄭若曦，葉錦霞，鄭春松，張婷，戴雨婷，洪江從，李民，吳廣文

(1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；4.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350003)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是中老年人常見的關節疾病，我國60歲以上人群中KOA的患病率大于60%[1]。KOA的主要臨床表現為膝關節疼痛、腫脹、僵硬、活動受限，嚴重影響患者生活質量[2-4]。獨活寄生湯出自孫思邈的《備急千金要方》，臨床用于KOA的防治，療效顯著[5-8]。我們前期研究[9]發現獨活寄生湯能夠延緩KOA模型大鼠膝關節軟骨退變，但其作用機制尚不明確。相關研究[10]表明，由于炎癥等因素影響，骨關節炎軟骨組織中的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)的表達受到干擾，影響軟骨細胞胞外基質蛋白的表達。為了探討獨活寄生湯治療大鼠KOA的作用機制，我們進行了相關動物實驗，現總結報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物2月齡SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠66只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005。實驗方案通過醫學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑鹽酸氨基葡萄糖膠囊(香港澳美制藥公司)，戊巴比妥鈉溶液(山東西亞化學工業有限公司)，mirVanaTMmiRNA提取試劑盒、TRIzol(美國Invitrogen公司)，Mir-XTMmiRNA逆轉錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本Takara公司)，PrimeScriptTMRT mRNA 逆轉錄試劑盒、AceQqPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(中國Vazyme公司)，苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)、抗聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型膠原蛋白(CollagenⅡ)抗體(美國Abcam公司)，抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G二抗(美國CST公司)，SuperLumia HRP底物ECL高敏試劑盒(美國Abbkine公司)。

1.3 實驗儀器NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Invitrogen公司)，PCR儀(美國Bio-rad公司)，7500 Fast實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)系統(美國ABI公司)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，凝膠電泳系統(美國ThermoFisher公司)，小型槽式轉印系統、化學發光成像系統(美國Bio-rad公司)。

2 方 法

2.1 獨活寄生湯制備方法獨活寄生湯藥物組成：獨活9 g，桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防風、肉桂、細辛、當歸、川芎、熟地黃、白芍、人參片、茯苓、甘草片各 6 g。將上述藥物搗碎，按照固液比1∶10加入蒸餾水，煎煮1.5 h，過濾，加入等量冷水再次煎煮；連續煎煮3次，將3次藥液合并后，采用旋轉蒸發器濃縮后真空干燥，收集干粉于-20 ℃保存備用；使用時稱取干粉加入蒸餾水溶解，配制濃度為0.93 g·mL-1。

2.2 模型建立與干預方法將66只大鼠適應性喂養1周后，隨機選取48只大鼠，采用改良Hulth法[9]建立大鼠KOA模型，隨機選擇3只正常大鼠和3只建模大鼠進行鑒定。證實建模成功后，將剩余的15只正常大鼠納入正常對照組，采用隨機數字表將剩余的45只KOA模型大鼠分為KOA模型組、獨活寄生湯治療組、鹽酸氨基葡萄糖治療組，每組15只。參照“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”[11]計算大鼠給藥量，正常對照組和KOA模型組大鼠按照每天10 mL·kg-1以0.9%生理鹽水灌胃，獨活寄生湯治療組大鼠按照每天10 mL·kg-1以獨活寄生湯(濃度為0.93 g·mL-1)灌胃，鹽酸氨基葡萄糖治療組按照每天10 mL·kg-1以鹽酸氨基葡萄糖溶液(濃度為0.015 g·mL-1)灌胃，連續干預12周。12周后，于腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，使用劑量2 mL·kg-1。切取雙側脛骨近端和股骨遠端的軟骨組織，置入-80 ℃冰箱中，儲存備用。

2.3 大鼠脛骨近端軟骨組織中miR-675-3p檢測方法取各組大鼠脛骨近端軟骨組織，分別加入液氮研磨至細末，稱取25 mg，用mirVanaTMmiRNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μg的RNA，采用Mir-XTMmiRNA逆轉錄試劑盒生成cDNA。采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行RT-qPCR檢測miR-675-3p的表達，以U6為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-675-3p的相對表達量。PCR擴增引物見表1。

2.4 大鼠脛骨近端軟骨組織中lncRNA H19及軟骨組成相關基因mRNA檢測方法取各組大鼠脛骨近端軟骨組織，分別加入液氮研磨至細末，稱取25 mg，采用TRIzol法提取總RNA，取1 μg的總RNA，采用PrimeScriptTMRT mRNA逆轉錄試劑盒生成cDNA。采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行RT-qPCR檢測lncRNA H19和Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表達，以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA H19和Aggrecan、CollagenⅡmRNA的相對表達量。PCR擴增引物見表1。

表1 PCR擴增引物序列

2.5 大鼠股骨遠端軟骨組織中軟骨組成相關基因蛋白檢測方法取各組大鼠股骨遠端軟骨組織，分別加入液氮研磨至細末，稱取20 mg，加入200 μL含1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解液，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液并置于沸水中煮5 min。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，每孔加入30 μg蛋白。采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，室溫封閉1 h，加入抗Aggrecan、CollagenⅡ、β-actin抗體(抗體稀釋比例為1∶1000)孵育過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，采用SuperLumia HRP底物ECL高敏試劑盒顯影，并拍照保存。采用Image Lab軟件處理圖片，提取蛋白條帶的灰度值，并以β-actin蛋白為基準進行標準化處理，計算蛋白條帶的相對灰度值，比較蛋白的相對表達水平。

2.6 數據統計方法采用SPSS22.0統計軟件對所得數據進行統計學分析。4組大鼠關節軟骨組織中miR-675-3p、lncRNA H19、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA和Aggrecan蛋白表達量的組間比較均采用Welch或Brown-Forsythe檢驗，組間兩兩比較均采用Games-howell檢驗；4組大鼠關節軟骨組織中CollagenⅡ 蛋白表達量的組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結 果

3.1 大鼠飼養結果KOA模型組大鼠因肺栓塞死亡2只，獨活寄生湯治療組大鼠因腹瀉死亡1只，鹽酸氨基葡萄糖治療組大鼠因肺栓塞死亡1只。

3.2 大鼠脛骨近端軟骨組織中KOA相關基因的RNA表達結果正常對照組、KOA模型組、獨活寄生湯治療組、鹽酸氨基葡萄糖治療組大鼠脛骨近端軟骨組織中miR-675-3p、lncRNA H19、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表達量比較，組間差異均有統計學意義。KOA模型組、獨活寄生湯治療組、鹽酸氨基葡萄糖治療組大鼠脛骨近端軟骨組織中miR-675-3p、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表達量均低于正常對照組(miR-675-3p：P=0.000；P=0.003；P=0.002；Aggrecan mRNA：P=0.000；P=0.000；P=0.000；CollagenⅡmRNA：P=0.000；P=0.000；P=0.000)；KOA模型組大鼠脛骨近端軟骨組織中lncRNA H19的表達量低于正常對照組(P=0.002)，獨活寄生湯治療組、鹽酸氨基葡萄糖治療組大鼠脛骨近端軟骨組織中lncRNA H19的表達量與正常對照組比較，差異無統計學意義(P=0.058，P=0.069)；獨活寄生湯治療組、鹽酸氨基葡萄糖治療組大鼠脛骨近端軟骨組織中miR-675-3p、lncRNA H19、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表達量均高于KOA模型組(miR-675-3p：P=0.000；P=0.000；lncRNA H19：P=0.000；P=0.000；Aggrecan mRNA：P=0.000；P=0.000；CollagenⅡmRNA：P=0.000；P=0.000)；獨活寄生湯治療組大鼠脛骨近端軟骨組織中miR-675-3p、lncRNA H19、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA的表達量與鹽酸氨基葡萄糖治療組比較，組間差異均無統計學意義(P=0.922；P=0.778；P=0.857；P=0.904)。見表2。

表2 4組大鼠脛骨近端軟骨組織中miR-675-3p、lncRNA H19及軟骨組成相關基因的mRNA相對表達量

3.3 大鼠股骨遠端軟骨組織中軟骨組成相關基因的蛋白表達結果正常對照組、KOA模型組、獨活寄生湯治療組、鹽酸氨基葡萄糖治療組的大鼠股骨遠端軟骨組織中Aggrecan和CollagenⅡ的蛋白表達量比較，組間差異均有統計學意義。KOA模型組、獨活寄生湯治療組大鼠股骨遠端軟骨組織中Aggrecan的蛋白表達量均低于正常對照組(P=0.003；P=0.004)，鹽酸氨基葡萄糖治療組大鼠股骨遠端軟骨組織中Aggrecan的蛋白表達量與正常對照組相比，差異無統計學意義(P=0.078)，KOA模型組、獨活寄生湯治療組、鹽酸氨基葡萄糖治療組大鼠股骨遠端軟骨組織中CollagenⅡ的蛋白表達量均低于正常對照組(P=0.000；P=0.028；P=0.018)，獨活寄生湯治療組、鹽酸氨基葡萄糖治療組大鼠股骨遠端軟骨組織中Aggrecan和CollagenⅡ的蛋白表達量均高于KOA模型組(Aggrecan：P=0.025；P=0.034；CollagenⅡ：P=0.003；P=0.004)，獨活寄生湯治療組大鼠股骨遠端軟骨組織中Aggrecan和CollagenⅡ的蛋白表達量與鹽酸氨基葡萄糖治療組比較，組間差異均無統計學意義(P=0.999；P=0.775)。見表3、圖1。

表3 4組大鼠股骨遠端軟骨組織中軟骨組成相關基因的蛋白相對表達量

Aggrecan：聚集蛋白聚糖；CollagenⅡ：Ⅱ型膠原蛋白；β-actin：β-肌動蛋白；①正常對照組；②膝骨關節炎模型組；③獨活寄生湯治療組；④鹽酸氨基葡萄糖治療組。

4 討 論

LncRNA是一類沒有編碼蛋白質功能的RNA，曾被認為是轉錄過程中產生的“噪音”。隨著研究的進一步深入及高通量測序等技術的應用，多項研究發現lncRNA廣泛參與基因的轉錄、翻譯及蛋白的相互作用等生物學過程[12-15]。miRNAs在人類的體液如血液、尿液、關節液及唾液中能夠穩定存在，且具有良好的組織特異性和時序性，miRNA在骨關節炎的早期診斷及治療方面具有較大優勢[16]。研究表明，lncRNA和miRNA在骨關節炎發展進程中發揮重要作用[17]。Song等[18]研究發現，與正常軟骨組織比較，骨關節炎患者軟骨組織中lncRNA的表達異常，而lncRNA的表達異常可能導致軟骨細胞胞外基質降解。Fu等[19]采用微陣列分析技術分析骨關節炎患者的軟骨組織樣本，結果顯示，與正常軟骨組織相比多個lncRNA上調或下調，認為lncRNA可能是診斷和治療骨關節炎的潛在生物標志物。

LncRNA H19是最早發現的lncRNA之一，其在轉錄過程中被加工為miR-675-3p和miR-675-5p；miR-675-5p在軟骨組織中表達量較低，且沒有靶目標，逐漸被核酸酶降解；因此，miR-675-3p是lncRNA H19在軟骨組織內影響細胞外基質的主要活性形式[20-21]。Shen等[22]研究發現，在骨關節炎患者的軟骨組織中，miR-675-3p的表達量下降，且在體外以白細胞介素-1干預正常的人軟骨細胞后，miR-675-3p的表達量下降。本研究發現KOA模型組大鼠膝關節軟骨組織中miR-675-3p和lncRNA H19的表達量均低于正常對照組，獨活寄生湯治療組大鼠膝關節軟骨組織miR-675-3p和lncRNA H19的表達量均高于KOA模型組，表明獨活寄生湯能夠促進KOA模型大鼠膝關節軟骨組織miR-675-3p和lncRNA H19的表達，提示其可能通過上調miR-675-3p和lncRNA H19的表達發揮治療KOA的作用。

Aggrecan和Collagen Ⅱ是軟骨細胞胞外基質的重要組成成分，其相互交錯形成網狀結構增強了軟骨的機械強度，使得膝關節軟骨能夠抵抗較強的剪切力[23]。研究表明，Aggrecan和CollagenⅡ能夠被基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族蛋白降解[24]。MMP-1和MMP-13具有較強的軟骨細胞胞外基質降解能力，其中MMP-13對Collagen Ⅱ的降解能力是MMP家族蛋白中最強的[25]。Seidl等[20]研究發現，通過脂粒Lip2000轉染人軟骨細胞沉默miR-675-3p能夠上調MMP-1和MMP-13的表達。Dudek等[26]研究發現，在正常人軟骨細胞中沉默lncRNA H19或miR-675均會降低CollagenⅡ表達，而過表達miR-675會增加CollagenⅡ表達。本研究發現KOA模型組大鼠膝關節軟骨組織中Aggrecan、CollagenⅡ mRNA和蛋白的表達量均低于正常對照組，采用獨活寄生湯治療的大鼠膝關節軟骨組織中Aggrecan、CollagenⅡ mRNA和蛋白的表達高于KOA模型組；推測lncRNA H19和miR-675-3p的表達上調能夠促進Aggrecan和CollagenⅡ表達，但至于獨活寄生湯是如何調控lncRNA H19和miR-675-3p，尚需后期進一步深入研究。

本研究結果表明，獨活寄生湯治療大鼠KOA的作用機制，可能與其能夠上調miR-675-3p、lncRNA H19的表達進而促進Aggrecan、CollagenⅡ的表達有關。