ABA-PAM 協同處理對冷脅迫條件下牧草及根際土壤的影響

費雪婷，邵歡歡，陶靈琳，楊 雯，陶 向，何欣怡，倪維敏，雍 彬

（四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101）

草地生態系統是最重要的陸地生態系統之一，近年來草原大面積鹽漬化、沙化、退化，使我國草原生產力急劇下降，其中又以青藏和川西北等高緯度、高海拔地區草地退化現象尤為嚴重，對我國生態環境構成嚴重威脅，并制約了社會經濟的持續、穩定、健康發展［1-4］.高寒地區植被通常較低矮，生物量低，生物群落結構簡單，抗干擾和自我恢復能力低.有研究發現，高寒草地植被生長的限制因子是溫度［5］.

多年來“人口增長—牲畜數量增加—草地過載—草地退化—生態失衡”的惡性循環導致西部草地鹽漬化、沙化、退化迅速，加之極端氣候的影響，草原荒漠化不斷蔓延.四川省西北部的高原區作為我國5大牧區之一，地處青藏高原東南緣，草地面積達8.2×106hm2，占四川可利用草地面積的65%［2］，是長江水系金沙江、雅礱江、大渡河，以及黃河支流白河和黑河的源頭.近30 年來，該區草地沙化面積已達8.7×105hm2，嚴重影響河流的來水量及水質［3］.

聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAM）是一種具有超強吸水和保水能力的保水劑，它可以抑制土壤水分的蒸發，增強土壤的持水功能，因此對沙質土壤水分的調控具有重要作用［6-7］.利用保水劑可以提高退化土地的土壤含水量，促進植被生長［8］.

植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）最早因其可促使植物葉片脫落而得名，且長時間被認為是一種生長抑制物質.隨著研究的不斷深入，人們發現ABA在植物的整個生長發育過程中發揮著重要的調控作用，是植物非生物脅迫相應的調控中心［9-11］.遭受環境脅迫后，植物通過調節ABA 生物合成與降解的動態平衡，提升體內ABA含量［12-13］.大量的研究表明外施ABA 抑制種子萌發，能提升植株的脅迫敏感性［14-15］.同時，也有研究報道外施低濃度ABA可有效降低植物的抗逆性與病害發生率［16-19］，其中施加外源ABA 可以顯著提高植株的抗寒性［20-21］.祝長龍等［18］研究發現，外施ABA 提升植物脅迫敏感性的前提是ABA 濃度高于閥值，當濃度低于閥值時并不會導致脅迫敏感性的提升.因此，近年來ABA 也被稱為“逆境脅迫激素”、“抗逆誘導信使”.然而，因為植物體內濃度低、分離純化成本高等原因，長期以來ABA 價格高昂，難以應用于生產實踐中.譚紅等［22］從灰葡萄孢霉菌中分離鑒定到誘抗活性產物脫落酸，通過發酵ABA 產量＞1 g／L，大大降低了ABA 的市場價格，基于此研發的生物農藥“S-誘抗素”已實現了工業化生產及數百萬公頃的大田推廣.然而，目前針對脫落酸對植物抗逆性影響的研究以及保水劑對退化草地的修復的研究較多，但脫落酸-聚丙烯酰胺（ABAPAM）協同修復退化草地植被目前還沒有相關研究.

本研究以青藏高原地方草種青海冷地早熟禾為材料，基于盆栽試驗，研究了冷脅迫條件下ABAPAM協同處理對青海冷地早熟禾植株生長及根際土壤環境狀況的影響.研究結果為ABA-PAM協同處理在高寒草地恢復中的應用奠定了理論基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料實驗所用沙化土壤取自四川省若爾蓋縣轄曼鎮沙化草地，取樣地海拔3 500 m，氣候特點為冬春季長且嚴寒多風，夏秋季短而多雨潮濕.實驗所用牧草為青藏高原地方草種冷地早熟禾.

1.2 方法

1.2.1牧草盆栽 將采集的沙土用40 目篩子篩除植物殘根、落葉等雜質，裝入口徑13 cm ×13 cm的方形花盆，每盆沙土2.5 kg，并均勻分成2 組（每組12 盆），其中一組沙土按照8 g／m2的用量均勻拌入PAM.按照0.3 g／盆的用量準確稱取健康飽滿的冷地早熟禾種子，與盆中上層土壤混合均勻，澆水100 mL，在光照培養箱中以溫度25 ℃、光周期16／8 h條件培養.播種后每5 d 澆水一次，澆水量為100 mL／次／盆.待牧草生長至約5 cm時，-10 ℃冷脅迫16 h.隨后分別將施加PAM和未施加PAM的2 個實驗組再均分為2 組（每組6 盆），對其中一組按450 L／hm2（30 L／畝）的用量噴施2 mg／L ABA，對照組噴施等體積蒸餾水，每12 d 噴施一次，共噴施3 次.

1.2.2牧草生長參數測定 牧草種子萌發后每隔7 d對牧草高度進行測量.實驗結束后將冷地早熟禾整株拔出，洗凈，去除多余沙土，用吸水紙吸干水分，于電子天平上稱量冷地早熟禾苗的鮮質量、根質量，并測定其根部長度及株高.將冷地早熟禾的根系用清水洗凈，剪刀剪下后放入裝有清水的培養皿中，用尖頭鑷子將聚集的根系撥開，置于根系掃描儀（LA2400，Regent）中進行掃描，以RootAnalysis根系分析軟件進行根系表面積分析.

1.2.3葉片生理生化測定 葉片洗凈后液氮速凍備用.葉片的過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）和過氧化氫（H2O2）、脯氨酸、葉綠素含量等的以南京建成科技有限公司的檢測試劑盒進行測定，試劑盒對應貨號分別為：A007-1-1、A084-3-1、A001-1-2、A003-1-2、A064-1、A107-1-1、A147-1-1，測定方法參照試劑盒使用說明書.

1.2.4土壤理化性質測定 土壤中堿性蛋白酶、脲酶、中性磷酸酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、蔗糖酶等酶活性采用索萊寶土壤酶活試劑盒測定，試劑盒對應貨號分別為：BC0885、BC0125、BC0465、BC0145、BC0115、BC0245，測定方法參照試劑盒使用說明書.

1.2.5土壤微生物測定 稱取5 g 土壤，置于45 mL無菌水中，稀釋后0.1 mL 涂布于不同培養基中，觀察、統計細菌、真菌、放線菌數量.細菌培養采用LB固體培養基，真菌培養采用孟加拉紅固體培養基，放線菌培養采用高氏固體培養基，計數方法采用稀釋涂抹平板法.微生物數量以每克樣品的菌數來表示：

2 結果與分析

2.1 ABA-PAM 協同處理對植株抗凍能力的初步分析冷地早熟禾種子萌發并生長至高度5 cm后，-10 ℃冷脅迫16 h，結果顯示ABA-PAM 協同處理的試驗組植株（圖1D）生長效果優于對照組（圖1A），添加了PAM 但是未噴施ABA 的試驗組效果不明顯（圖1C），未添加PAM僅噴施了低濃度ABA的試驗組效果不太理想.結果表明ABA-PAM協同處理可以在一定程度上提高植物的抗凍能力.

圖1 冷脅迫下ABA-PAM協同處理后植株生長情況Fig.1 Plant growth after ABA-PAM synergistic treatment under the cold stress

2.2 ABA-PAM 協同處理對牧草植株生長的影響為分析ABA和PAM的施用對冷地早熟禾植株生長的影響，分別對植株株高、鮮質量、根長、根表面積進行檢測（表1）.結果表明：冷脅迫處理時，用PAM的實驗組中ABA噴施株高可達（8.84±0.11）cm，而未噴施ABA的實驗組株高為（7.74 ±0.21）cm，這說明相比單獨的ABA處理，ABA-PAM協同處理可促進植株的生長.此外，ABA-PAM協同作用后植株葉片鮮質量、根系表面積分別為（0.92±0.19）g和（0.43±0.13）cm2，較對照組和單獨施用ABA或PAM組均顯著增加.ABA-PAM協同處理組的根長為（7.40 ±0.09）cm，顯著高于ABA（（6.78±0.11）cm）或PAM（（5.72±0.34）cm）單獨施用組，但略低于對照組（（7.58 ±0.54）cm）.

表1 ABA-PAM協同處理對株高、鮮質量及根系的影響Tab.1 Effects of ABA-PAM treatment on the plant height，the fresh weight and the root system

2.3 ABA-PAM 協同處理對葉片生理生化指標的影響植物組織中CAT、SOD、POD酶活性及MDA、脯氨酸含量是影響植物抗逆和抗氧化等能力的重要指標.冷地早熟禾經冷脅迫處理，噴施ABA 后CAT、POD 和SOD 酶活分別為（7.20 ± 0.68）、（51.97 ±0.26）、（108.33 ±1.98）U／mg prot，較對照有顯著增加（（4.24 ±1.36）、（45.87 ±0.68）、（86.57 ±0.82）U／mg prot），如圖2 所示.

圖2 ABA-PAM協同處理對葉片生理生化指標的影響Fig.2 The effect of ABA-PAM cotreatment on physiology and biochemistry of the leaf

土壤中單獨施用PAM 可能對葉片CAT、POD和SOD酶活無促進作用，但ABA-PAM協同處理組的CAT（（5.29±0.36）U／mg prot）和SOD（（96.96±1.00）U／mg prot）酶活均較對照組、PAM單獨施用組高.可見在冷脅迫處理后噴施ABA 可提高植株葉片內CAT、POD、SOD活性，植株可以表現出更高的抗氧化保護酶活力.單獨施用PAM及ABA-PAM協同處理后牧草葉片丙二醛質量分數分別為（1.48 ±0.48）和（1.87 ±0.52）nmol／g prot，其質量分數相比對照組（（5.70 ±0.71）nmol／g prot）及ABA單獨施用組（（7.78 ±0.39）nmol／g prot）顯著降低.脯氨酸作為蛋白質組成的基本氨基酸之一，其游離態廣泛存在于植物體內，脯氨酸含量的高低可反映植物抗逆性的強弱.在冷脅迫處理后，ABA-PAM協同處理可促使脯氨酸的積累，其質量分數為（218.90 ±6.25）μg／g，高于對照組及ABA和PAM單獨施用組（圖3）.葉綠素與植物生長存在密切的聯系，ABA-PAM 協同處理的牧草葉片中葉綠素質量分數為（13.96 ±0.50）mg／g，與ABA（（9.55 ± 0.71）mg／g）、PAM（（11.97 ±1.76）mg／g）等單獨施用組相比顯著增加.

圖3 ABA-PAM協同處理對脯氨酸、葉綠素的影響Fig.3 The effect of ABA-PAM cotreatment on the proline and the chlorophyll

2.4 ABA-PAM協同處理對土壤酶活的影響土壤中的蔗糖酶可將蔗糖分解為植物和微生物可利用的葡萄糖和果糖，因此可作為評價土壤肥力的重要指標.冷地早熟禾經冷脅迫后，單獨施用ABA 或PAM均可增加蔗糖酶的活性，活性分別為（132.42 ±2.82）U／g、（108.70 ±8.56）U／g，而ABA-PAM 協同處理條件下蔗糖酶活力最高可以達到（133.63 ±6.27）U／g（圖4A）.多酚氧化酶可催化芳香族化合物轉化為醌，醌與土壤中的蛋白質、氨基酸等物質可反應生成有機質和色素，因此多酚氧化酶可用于土壤環境修復.本研究發現單獨施用PAM 可顯著增加多酚氧化酶酶活，單獨施用PAM及ABA-PAM協同處理后葉片的多酚氧化酶酶活性分別達到（842.62 ±4.52）U／g 和（850.45 ±9.04）U／g，較對照組（（730.45 ±7.83）U／g）和ABA 單獨施用組（（722.63 ±20.71）U／g）有較為明顯的提升（圖4B）.作為水解尿素過程中的關鍵酶，土壤脲酶的酶促作用產物為氨和碳酸，因此土壤脲酶活性可反應土壤無機氮供應能力.結果顯示單獨噴施ABA 后脲酶活性為（0.069 ±0.008）U／g，活性顯著高于其余3個實驗組（（0.044 ±0.009）、（0.045 ±0.020）、（0.044 ±0.006）U／g）（圖4C）.磷酸酶的酶促作用可使土壤中有機磷化合物或無機磷酸鹽轉化成可供植物吸收的無機態磷，可作為表征土壤磷轉化和植物磷吸收的重要指標.冷脅迫處理后，單獨施用ABA、PAM或聯合施用PAM和ABA對磷酸酶酶活無顯著影響（圖4D和圖4E）.土壤蛋白酶參與土壤中蛋白質的水解，其產物可作為植物氮源之一.研究結果顯示，在冷脅迫處理后施用PAM 酶活為（0.86 ± 0.12）U／g，顯著高于對照組（（0.59 ±0.01）U／g）、ABA單獨施用組（（0.53±0.01）U／g），而ABA-PAM協同處理后葉片的土壤蛋白酶活性為（0.76 ±0.03）U／g，可見噴施ABA 對土壤蛋白酶活性無顯著影響，但PAM 的施用可以提升土壤蛋白酶的酶活（圖4F）.

圖4 ABA-PAM協同處理對土壤相關酶的影響Fig.4 Effects of ABA-PAM cotreatment on soil related enzymes

2.5 ABA-PAM 協同處理對土壤微生物的影響使用稀釋涂布平板計數法對種植冷地早熟禾并經冷脅迫的土壤中的微生物數量進行測定，結果發現ABA單獨施用組、PAM單獨施用組和ABA-PAM協同處理的土壤中的真菌、放線菌、細菌數量均高于對照組.從真菌數量來看，ABA單獨處理組的數量最高，達到（514.25±48.79），其次為ABA-PAM協同處理組（341.33±37.29）和PAM處理組（227.00 ±27.36）；從放線菌數量來看，PAM單獨處理組數量最高，達到（207.00±3.92），其次為ABA 單獨處理組（182.75 ±20.17）和ABA-PAM協同處理組（152.00 ±13.34）；從細菌數量來看，ABA單獨處理組數量最高（450.25±7.89），其次為PAM 單獨處理組（260.75 ±6.65）和ABA-PAM協同處理組（200.25±2.63）.如表2所示.

表2 ABA-PAM協同處理對土壤微生物的影響Tab.2 Effects of ABA-PAM cotreatment on soil microorganisms

3 討論

川西北高寒草地是長江和黃河上游重要的生態屏障，在高原地區的水土保持、區域氣候調節和生物多樣性保護等方面發揮了重要的作用［2］.但是近年來由于人類過度放牧、濫墾濫挖、鼠害加劇及自然條件的改變等因素綜合作用下，川西北高寒草地生態系統出現了嚴重的水土流失、土壤沙化和草地退化等現象，使當地的自然災害頻發，生態平衡出現較為嚴重的失調現象，而草地的退化進一步制約了該地區畜牧產業的發展［23］.除人為因素外，川西北高寒草地屬高原寒溫帶濕潤氣候，雖然年均降雨量可達到600～700 mm，但是，一方面由于其常年平均氣溫在0～4 ℃，影響了牧草的生長；另一方面，降雨量很不均衡，主要集中在5—9 月，冬季降雨量最少，這導致冬季更加干旱，干旱作用會進一步加劇冷脅迫對植物造成的損傷，使牧草更易發生退化，也讓草原生態更加脆弱［2］.保水劑作為一種強力吸水的凝膠，可以吸收自身重量數百倍甚至上千倍的水分，并通過緩慢釋放供給植物的利用與生長，因此可以增加土壤水分、提高土壤肥力、促進植物出苗率和成活率，在農業生產中多有應用［24］.

此外，大量研究表明ABA 與植物所遭遇的干早、高鹽、低溫、損傷、低氧、光照以及病原體侵染等有關，是植物體響應逆境脅迫的重要信號，而外源ABA可能具有通過改變植物的代謝，提升其水分利用率等來提高植物的抗寒性.為了提升牧草對川西北高寒草地特殊的氣候的適應能力，本研究通過外源低濃度ABA與保水劑結合使用，并對其生長狀態和土壤性質進行了測定.結果發現PAM（8 g／m2）與低濃度ABA（2 mg／L）聯合使用的情況下，冷地早熟禾的在冷脅迫時生長效果優于對照組、單獨施用ABA或PAM 組，這表明PAM 與ABA 的聯合使用可以降低低溫脅迫對植物造成的影響作用，從而促進其生長.低濃度的外源ABA 可以提升植物的抗干旱能力，但是施用ABA 對不同的植株品種作用并不相同，有的植株干旱脅迫噴低濃度ABA 后會出現短暫的休眠作用，從而導致其生長速率減慢［25-26］，而對有的植株則可以提升其生長作用（如株高、根長和生物量等）［27］.此外，郭貴華［26］研究發現如果不進行干旱處理（水分充足），僅噴施低濃度ABA則可以明顯促進水稻的生長.

從本研究結果來看，添加PAM 可以明顯緩解土壤中的干旱脅迫，同樣明顯促進了冷地早熟禾的生長作用，而干旱脅迫下噴施ABA 則可能會使冷地早熟禾出現一定的休眠作用，導致冷地早熟禾的生長收到一定的抑制.從CAT、SOD、POD 酶活性測定來看，單獨施用ABA的酶活力最高，這與ABA可以在低溫脅迫條件下提高細胞內的保護酶系統（如SOD、POD、CAT等）的協同作用來降低活性氧對細胞的傷害有關，而PAM 的添加則可以增加土壤中的水分含量，也有研究發現，隨著水分含量的增加，細胞內的保護酶系統的酶活力則會有所下降，因此PAM與ABA的聯合使用可能會使其細胞內的保護酶的酶活力低于單獨ABA 的使用［28］.單獨施用PAM及ABA-PAM協同處理后牧草葉片丙二醛含量顯著低于對照組和ABA 單獨施用組，這可能與土壤水分含量的增加可以降低植物體內的MDA含量有關［29］，植物在受到冷脅迫時細胞內游離脯氨酸含量會出現明顯的增加，而且耐寒性越好的植物中游離脯氨酸的含量相對更高［30］，從脯氨酸含量來看，ABA-PAM 協同處理后牧草葉片中脯氨酸含量最高，對照中脯氨酸含量最低，這表明土壤中水分的含量增加和外源低濃度ABA 的噴施可以有助于提升植物細胞內的脯氨酸含量.有研究發現低濃度的外源ABA可以提升干旱脅迫下植物根際土壤中多種土壤的酶活力，如磷酸酶（中性和酸性）、蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶等［27］.而本研究也發現噴施了低濃度ABA、PAM單用和ABA-PAM協同處理的蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶、蔗糖酶等多種土壤酶活力總體上相比對照相對較高，可見低濃度的外源ABA及PAM施用后對牧草生長的土壤環境中的蛋白酶、脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶等活性有促進作用，這可能與ABA 對植物的生理生化作用的影響對根系分泌改善有關.同時，施用PAM提升土壤的水分含量也有助于提升土壤酶活力，從促進了植物對營養的吸收作用.經施用ABA、PAM 以及ABAPAM協同處理后的土壤微生物的數量均高于對照組，也有研究發現低濃度的ABA 的使用可以一定程度上提升土壤中的細菌、真菌和放線菌的數量［27］，但是某些保水劑的使用有可能會降低土壤中微生物的數量［31］，這可能與ABA-PAM協同處理后土壤微生物的數量低于ABA 單獨處理組有一定的關系.

致謝成都市科技局科技惠民項目（2016-HM01-00046-SF）和四川師范大學“大學生創新性實驗計劃”項目（S201910636417）對本文給予了資助，謹致謝意.