食品中志賀氏菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展

盧 鑫，王立娟 ，郭 威，馬曉燕，張 偉3,4,

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院, 河北滄州 061100；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院, 河北保定 071001；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北保定 071001；4.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點實驗室，河北保定 071001）

志賀氏菌（Shigella）是引起人類腸道疾病的主要致病菌之一，具有很強的感染力和致病力，嚴(yán)重危害人們的身體健康[1]。志賀氏菌存在于乳制品、肉制品和蔬菜瓜果中，食用被志賀氏菌污染的食物或水可導(dǎo)致腹瀉、發(fā)熱、嘔吐以及脫水等臨床癥狀，甚至?xí)?dǎo)致死亡。全球64%的細(xì)菌性腹瀉疾病是由該細(xì)菌感染所致，每年約有1.6億人感染志賀氏菌，死亡人數(shù)高達(dá)110萬，其中大部分為五歲以下兒童及免疫缺陷人群[2]。在發(fā)展中國家由福氏志賀氏菌引起的腹瀉疾病位居前列。在我國，每年由志賀氏菌引起的疾病占食源細(xì)菌性疾病總數(shù)的8.5%，其死亡病例占食源性疾病死亡病例的5.9%[3]。因此，探究出一種快速靈敏、簡便高效的檢測志賀氏菌的方法迫在眉睫。

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，志賀氏菌的檢測方法可分為：傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和生物傳感器方法。自1897年發(fā)現(xiàn)志賀氏菌以來，其分離培養(yǎng)與常規(guī)鑒定技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟[4]。但是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法操作繁瑣，耗時費力，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。免疫學(xué)方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測，縮短了檢測時間，但該方法的靈敏度較低[5]。分子生物學(xué)方法可分為變溫擴(kuò)增技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）及其衍生技術(shù)和等溫擴(kuò)增技術(shù)如滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）和單引物等溫擴(kuò)增技術(shù)（Single primer isothermal amplification，SPIA）等。分子生物學(xué)方法利用聚合酶反應(yīng)，具有高靈敏、高特異、簡便快速的特點，被廣泛應(yīng)用于食源性病原菌的檢測。傳感器技術(shù)因其高靈敏度、操作簡單的特點，使該技術(shù)在致病菌檢測中具有廣闊前景。新興的檢測技術(shù)包括無酶信號放大技術(shù)和適配體技術(shù)，使檢測方法更加靈敏、特異，為病原菌檢測技術(shù)的發(fā)展提供了參考。

1 傳統(tǒng)檢測方法

食源性致病菌的傳統(tǒng)檢測技術(shù)在現(xiàn)行的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)里均有規(guī)范。作為食品微生物檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，《GB 4789.5-2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·食品微生物學(xué)檢驗·志賀氏菌檢驗》在志賀氏菌檢測中具有舉足輕重的地位。國標(biāo)檢測[6]方法包括前增菌、選擇性分離、生化鑒定和血清學(xué)鑒定，整個過程需要4～5 d，檢測限為1×104CFU/mL[7]。國標(biāo)方法的準(zhǔn)確性高且穩(wěn)定，但操作繁雜，靈敏度較低。Jung等[8]針對目標(biāo)菌株選擇性問題采用噬菌體擴(kuò)增測定法在多種混合細(xì)菌中成功地檢出鮑氏志賀氏菌。志賀氏菌的檢出率與增菌液和顯色培養(yǎng)基的選擇以及培養(yǎng)基滅菌的方式有密切關(guān)系。在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)痢疾志賀氏菌和鮑氏志賀氏菌，有雜菌時無法生長，容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。李志明等[9]在增菌培養(yǎng)基中加入新生霉素、胰胨葡萄糖肉湯及含表面活性劑吐溫，可以形成很好的厭氧環(huán)境培養(yǎng)志賀氏菌；在顯色培養(yǎng)基中加入抗生素，抑制了雜菌生長，保證了培養(yǎng)的準(zhǔn)確性。針對靈敏度低的問題，Tang等[10]將qPCR與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合檢測沙門氏菌和志賀氏菌，使傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的靈敏度提高了100倍。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法作為其他檢測方法的基礎(chǔ)，將逐漸滿足實際檢測的需要。

2 免疫學(xué)檢測方法

免疫學(xué)方法的基本原理：抗原與抗體特異性結(jié)合[11]，其在食源性致病菌檢測應(yīng)用中最大的優(yōu)點在于檢測目標(biāo)的多樣性，不僅可以檢測樣品中痕量致病菌，還能檢測細(xì)菌毒素[12]。目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)快速檢測技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）技術(shù)[13]、免疫磁珠（Immunomagnetic beads，IMB）技術(shù)[14]和免疫層析（Immunochromatography assay，ICA）技術(shù)[15]，近年來免疫學(xué)方法不斷發(fā)展，實現(xiàn)了志賀氏菌的高通量、快速靈敏檢測，大大提高了檢測效率，如表1所示。

免疫學(xué)方法操作簡便，可在15 min內(nèi)，實現(xiàn)致病菌多重檢測，如表1所示。Gupta[19]開發(fā)并標(biāo)準(zhǔn)化了檢測志賀毒素（STxB）的Dot-ELISA和夾心ELISA方法，其檢測限分別為9.75、9.7 ng/mL，該檢測方法特異性高，經(jīng)濟(jì)高效且可現(xiàn)場檢測。膠體金免疫色譜帶（ICS）大多采用膠體金作為比色檢測的報告劑，不需要特殊的儀器和試劑，使ICS的結(jié)果可視化。Song等[16]使用一步側(cè)流ICS方法對鮑氏志賀氏菌和大腸O157:H7進(jìn)行多重分析，與ELISA結(jié)果一致。Yahaya等[17]對側(cè)流免疫分析法（LFIAs）進(jìn)行研究，確定使用NC-HF135硝酸纖維素膜可提高LFIAs靈敏度。Chen等[20]將熒光微球和免疫色譜試紙（FMs-ICTS）方法與PCR結(jié)合進(jìn)行志賀氏菌的定量檢測，并且將其與多種定量方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示該方法具有高特異性和靈敏度，可以快速檢測病原體。為了簡化免疫學(xué)方法，Gene Fields? EHEC/SS試劑盒[18]應(yīng)運而生，其原理如圖1所示，用兩種引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：一種引物帶有標(biāo)記間隔序列，另一種引物帶有生物素標(biāo)記。PCR產(chǎn)物的標(biāo)記序列和與試紙上標(biāo)記序列互補的寡核苷酸（藍(lán)線）進(jìn)行雜交。利用核酸色譜成分可同時檢測腸沙門氏菌、志賀氏菌屬和腸出血性大腸桿菌的特異性基因，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果一致，說明該方法可代替實時PCR試劑盒用于致病菌基因的篩查。

圖1 Gene Fields? EHEC/SS的原理圖Fig.1 Schematic diagram of Gene Fields? EHEC/SS

表1 免疫學(xué)方法檢測志賀氏菌Table 1 Detection of Shigella by immunological methods

3 分子生物學(xué)檢測方法

隨著微生物學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性對病原微生物進(jìn)行鑒定已不能滿足實際檢測的需要，從分子水平上對生物大分子進(jìn)行分析逐漸成為研究熱點之一，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分。近幾年，分子生物學(xué)方法包括變溫擴(kuò)增技術(shù)和等溫擴(kuò)增技術(shù)，已被廣泛的應(yīng)用于食源性病原菌的快速檢測。

3.1 變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

變溫核酸技術(shù)（Alternating temperature nucleic acid testing，ATNAT）一般經(jīng)過高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟。基于ATNAT的技術(shù)以PCR技術(shù)及其衍生技術(shù)為主，目前在各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。ATNAT技術(shù)縮短了檢測時間，其高靈敏度和特異性使鑒定多種靶標(biāo)和病原體（包括新出現(xiàn)的菌株）成為可能[21]。但ATNAT需要昂貴的熱循環(huán)裝置，在資源有限的環(huán)境中進(jìn)行應(yīng)用及分析具有一定的局限性。如表2所示，近年來人們對PCR技術(shù)進(jìn)行了各方面的改進(jìn)，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的不足，使檢測方法更加靈活、準(zhǔn)確。

表2 PCR及其衍生技術(shù)檢測志賀氏菌Table 2 PCR and its derivative technology of Shigella detection

3.1.1 實時熒光PCR技術(shù) 1996年美國Applied Biosystems公司提出了一種定量核酸檢測技術(shù)—實時定量PCR（qPCR）[27]，該技術(shù)簡化了檢測步驟，減輕了勞動強度。實時熒光技術(shù)通過熒光染料或熒光標(biāo)記探針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，可實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程。常見的熒光染料以SYBR Green染料為主，使用簡便，成本低，且隨著產(chǎn)物DNA增多，熒光增強[28]，但濃度高時會抑制PCR反應(yīng)。熒光染料EvaGreen和LC Green Plus因高靈敏度和低抑制性，而得到廣泛應(yīng)用[29]。陳智瑾等[30]使用熒光染料EvaGreen結(jié)合實時熒光定量PCR檢測類志賀鄰單胞菌，靈敏度為2.5 CFU/mL，較SYBR Green檢測志賀氏菌的靈敏度（1000 CFU/g）高[31]。熒光標(biāo)記探針（TaqMan）方法雖擁有高特異性和靈敏度，對擴(kuò)增沒有抑制[23]，但是其成本要較染料法更高，而且探針設(shè)計復(fù)雜。分子生物學(xué)方法無法區(qū)分死菌DNA和活菌DNA而易造成假陽性結(jié)果，Mei等[32]建立了疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）實時熒光PCR技術(shù)檢測食品中志賀活菌的方法，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。RTQ-PCR和數(shù)字PCR是目前對食源性病原體進(jìn)行定量檢測的方法。與其他定量方法不同的是，數(shù)字PCR[26]是一種不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以定量檢測致病菌的方法，檢測時間短、特異性高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高。

3.1.2 多重PCR（MPCR）技術(shù) MPCR技術(shù)是可以同時檢測多種致病菌的技術(shù)，具有高靈敏、高通量的特點，能夠?qū)崿F(xiàn)對致病菌的高效、準(zhǔn)確檢測。現(xiàn)有很多技術(shù)與MPCR結(jié)合，He等[25]將熒光染料EvaGreen與MPCR結(jié)合檢測志賀氏菌，可達(dá)到實時高通量檢測的目的，且檢測方法簡便易操作；Ma等[24]將免疫磁珠分離（Immunomagnetic separation，IMS）技術(shù)和多重實時PCR（RT-MPCR）結(jié)合，同時檢測新鮮豬肉中的志賀氏菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球，其中志賀氏菌的檢出限為6.8 CFU/g，特異性高達(dá)100%，敏感性和準(zhǔn)確性高于99%。MPCR技術(shù)滿足了實際樣品檢測的需要，對樣品中的病原菌有較全面的檢測。

3.2 基因芯片

基因芯片技術(shù)又稱為寡核苷酸陣列或寡核苷酸芯片技術(shù)，其原理基于分子雜交。基因芯片可進(jìn)行高通量檢測，更加簡單快捷。王磊等[33]發(fā)明了一種檢測志賀氏菌血清型的基因芯片試劑盒，通過將待測樣品基因組DNA的引物進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記，檢測雜交信號從而判定志賀氏菌的血清型。Guo等[34]使用液態(tài)基因芯片對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和志賀氏菌三種食源性致病菌進(jìn)行檢測，其中志賀氏菌的檢測限低至21 CFU/mL。該方法為快速檢測食源性致病菌提供了高通量檢驗方法，從而實現(xiàn)快速、高通量檢測致病菌的目的。Fang等[35]用基因芯片同時檢測7種致病菌，將視覺微孔板芯片與MPCR結(jié)合，使檢測結(jié)果實現(xiàn)了可視化。Li[36]建立了視覺DNA微陣列并將其用于檢測食物中常見的致病菌，視覺微孔板芯片和MPCR組合用于檢測食品中福氏志賀氏菌，靈敏度為102CFU/mL。基因芯片技術(shù)可批量處理樣本，且耗時較短，特異性較強，對致病菌的檢測有較大的應(yīng)用價值。基因芯片檢測志賀氏菌相關(guān)技術(shù)如表3所示。

表3 基因芯片檢測志賀氏菌分析Table 3 Analysis of Shigella detected by gene chip

3.3 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

自20世紀(jì)90年代以來，等溫擴(kuò)增技術(shù)（Isothermal nucleic acid testing，INAT）用于檢測DNA、RNA、細(xì)胞、蛋白質(zhì)等目標(biāo)，通過恒定的溫度控制，使信號放大，從而檢測出目的菌。等溫擴(kuò)增技術(shù)不僅包括滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，還包括一些新的技術(shù)：重組聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)（Recombinase polymerase amplification，RPA）、跨越式滾環(huán)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）和交叉引物擴(kuò)增（Cross priming amplification，CPA）等。

將6種常見的等溫擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行歸納，如表4所示，等溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測時間相差甚微，通過與實時熒光結(jié)合，檢測時間縮短到40 min左右。王建昌等[43]建立了實時熒光SPIA技術(shù)檢測牛奶中的志賀氏菌，在44 min內(nèi)完成檢測。劉立兵等[44]使用實時熒光RPA技術(shù)檢測志賀氏菌，能夠在20 min內(nèi)完成反應(yīng)，其檢測限低至0.36 CFU/g。等溫技術(shù)在酶和引物設(shè)計方面，SRCA技術(shù)僅在BstDNA聚合酶和一對引物的作用下即可完成反應(yīng)。Wang等[45]使用SRCA方法檢測志賀氏菌，擴(kuò)增產(chǎn)物通過熒光可視化方法進(jìn)行驗證，檢測限為47 CFU/g。等溫技術(shù)可對多種致病菌同時進(jìn)行檢測，賈甜甜[46]建立了多重LAMP檢測牛奶中志賀氏菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的方法，其中志賀氏菌的檢測限為53.3 CFU/mL。綜上，等溫擴(kuò)增技術(shù)在一定程度上縮短了檢測時間，提高了擴(kuò)增效率，降低了檢測限，在志賀氏菌的實際檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。然而RCA和CPA技術(shù)在檢測志賀氏菌的研究中還需要進(jìn)一步探索。

表4 等溫擴(kuò)增技術(shù)比較Table 4 Comparison of isothermal amplification techniques

4 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是生物技術(shù)中較為先進(jìn)的檢測技術(shù)，可以快速、檢測微量致病菌。它是一種將生物感應(yīng)元件和物理化學(xué)檢測器結(jié)合，通過信號傳導(dǎo)和信號擴(kuò)大使結(jié)果以具體、形象的方式展現(xiàn)出來，包括光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器、壓電生物傳感器和生化傳感器等種類。Xiao等[47]研發(fā)了便攜式倏逝波光纖生物傳感器，可快速、高靈敏度地檢測志賀氏菌，將DNA探針固定在可以與熒光標(biāo)記的互補DNA雜交的光纖生物傳感器上，可以檢測到低至10-2CFU/mL的志賀氏菌，其檢測限與實時PCR一致。Zarei等[48]無標(biāo)記阻抗適體傳感器檢測痢疾志賀氏菌，檢出限低至1 CFU/mL。Feng等[49]使用新型金納米粒子比色適體傳感器，首先將具有高親和力的適體固定在AuNPs表面，通過目標(biāo)菌誘導(dǎo)AuNPs聚集進(jìn)行檢測，并與NaCl作用后，出現(xiàn)可視的顏色變化，可高效檢測實際樣品中的志賀氏菌，整個檢測過程在20 min內(nèi)完成。生物傳感器檢測時間短，設(shè)備逐漸趨于小型化、自動化。這些特性使其優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和其他分子檢測方法，非常適合現(xiàn)場檢測。另外生物傳感器方法滿足了現(xiàn)代工業(yè)對檢測技術(shù)應(yīng)用的需求，除具有高穩(wěn)定性、低成本高效益、高靈敏度和廣選擇性的特性外，它們還能夠在低目標(biāo)菌濃度下完成檢測。一方面生物傳感器技術(shù)在檢測志賀氏菌方面提供了先進(jìn)的技術(shù)支持，另一方面其操作復(fù)雜，且需要選擇出高靈敏度的檢測識別組件和準(zhǔn)確的讀取組件，在研發(fā)使用方面仍然存在瓶頸（表5）。

表5 生物傳感器技術(shù)檢測志賀氏菌Table 5 Biosensor technology of Shigella detection

5 新興檢測技術(shù)

5.1 無酶信號放大技術(shù)

現(xiàn)階段大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)都需要酶的催化作用，如在目的序列擴(kuò)增中DNA聚合酶起重要作用。無酶技術(shù)包括催化發(fā)夾組裝（Catalyzed hairpin assembly，CHA）和雜交鏈反應(yīng)（Hybridization chain reaction，HCR），能使細(xì)胞內(nèi)mRNA或miRNA的成像信號增強。CHA僅需要雜交和鏈交換反應(yīng)即可將信號放大，既不需要蛋白酶也不用DNA聚合酶，反應(yīng)僅涉及雜交過程。當(dāng)目標(biāo)DNA與發(fā)夾DNA結(jié)合形成新的核酸序列時，在傳感器中建立一個立足點，啟動CHA的循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)[53]。HCR需要穩(wěn)定的DNA單鏈暴露在目標(biāo)DNA片段后才能組裝，兩種穩(wěn)定的DNA發(fā)夾共存于溶液中，直到加入引發(fā)鏈雜交，產(chǎn)生類似于交替共聚物的刻痕雙螺旋[54]。利用HCR進(jìn)行擴(kuò)增和捕獲，使用產(chǎn)生的DNA聚合物從溶液中除去分析物。這兩種方法具有良好的重復(fù)性和可接受度，為食品、環(huán)境和醫(yī)藥等檢測提供了一個無標(biāo)記、無酶、低成本、直觀、簡單的平臺。有研究已將CHA與信號傳感器結(jié)合，用于肺炎鏈球菌的檢測，檢測限為156 CFU/mL。Duan等[55]利用無酶信號放大的DNA電路和核苷酸堿基類似物的固有熒光，基于CHA系統(tǒng)和吡咯并脫氧胞苷（P-DC）對寡核苷酸序列進(jìn)行檢測，較常規(guī)基于熒光核苷酸堿基類似物方法提高了3個數(shù)量級。Dai等[56]建立了基于自我復(fù)制催化發(fā)夾裝配（SRCHA）的快速信號放大DNA檢測微量DNA方法，15 min內(nèi)即可完成反應(yīng)，為實時快速生物分子分析提供了一種潛在的技術(shù)支持。

5.2 基于適配體的檢測技術(shù)

1990年Tuerk等[57]首次提出指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）并成功篩選出能夠與T4 DNA聚合酶特異性結(jié)合的單鏈RNA。適配體（Aptamer）是基于SELEX從人工合成的核酸序列文庫中篩選出的一段與相應(yīng)的配體高度親和的特異寡核苷酸序列。作為信號識別原件，適配體經(jīng)活性基團(tuán)修飾可被開發(fā)成傳感器，以實現(xiàn)高靈敏、特異性地識別蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)。基于適配體的傳感器技術(shù)在醫(yī)療診斷方面應(yīng)用較多，較少的應(yīng)用在食源性致病菌檢測方面。李聰[58]建立了適體與熒光定量PCR聯(lián)用檢測食源性蠟樣芽孢桿菌和志賀氏菌的新方法，志賀氏菌檢出限為3.0×10-2CFU/mL，為食源性致病菌檢測提供了新方法和技術(shù)參考。

6 結(jié)語與展望

隨著社會各界對食品安全的密切關(guān)注，對食品的檢測標(biāo)準(zhǔn)也不斷提高，開發(fā)出簡便快捷、準(zhǔn)確的檢測方法至關(guān)重要。志賀氏菌的檢測技術(shù)眾多，然各有利弊。目前檢測志賀氏菌的方法以傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法較常見，生物傳感器技術(shù)和新興檢測技術(shù)為志賀氏菌的檢測提供了技術(shù)參考。在實際檢測過程中，需根據(jù)實際情況的需要選擇合適的方法，或者將兩種甚至多種方法結(jié)合，彌補技術(shù)之間的不足。或?qū)⑿屡d技術(shù)與原有的方法（培養(yǎng)方法、分子生物學(xué)方法等）結(jié)合，簡單快捷、靈敏特異、低成本的檢測方法將會是未來檢測志賀氏菌技術(shù)發(fā)展的方向。