納豆不良風(fēng)味的研究進(jìn)展

高雅鑫，張蒙冉，侯麗真，高 潔，王鳳忠, ，李淑英,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 北京 100193；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新疆阿拉爾 843300）

心血管疾病一直是世界上發(fā)病率和死亡率最高的慢性疾病，該趨勢(shì)持續(xù)增長并趨于年輕化[1]。《中國心血管與健康疾病報(bào)告（2019）》顯示，我國現(xiàn)有心血管疾病患病人數(shù)為3.3億，每5例死亡病例中就有2例由心血管疾病引起，占比高達(dá)40%[2]，其中血栓是引起心血管疾病人群死亡和致殘的首要原因[3]。目前治療血栓性心血管疾病的臨床藥物多以尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶等纖溶酶原激活劑為主，但這類藥物需靜脈注射，存在半衰期短、毒副作用大、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，不易成為大眾可普遍消費(fèi)的藥品[4]。

納豆（Natto）是由經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵蒸煮過的大豆制成的一種功能性食品，因富含納豆激酶而具有防治心血管疾病的功效[5-6]。納豆激酶具有多效溶栓功效，主要表現(xiàn)為可以直接溶解血栓，也可以激活機(jī)體的血栓溶解系統(tǒng)并抑制機(jī)體的凝血系統(tǒng)[7]。與臨床藥物相比，具有可口服、半衰期長、生產(chǎn)成本低廉、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。因此，納豆制品在日本一直被作為有效預(yù)防心血管疾病的最佳食品而備受推崇。日本國立癌癥中心研究結(jié)果表明常吃納豆的人群癌癥死亡率比不常吃的人群降低了10%[10]。世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)顯示，我國心血管疾病的發(fā)病率是日本的75倍。中國人的飲食追求色香味俱全，因而，獨(dú)具“氨臭味”的納豆一直未能在中國消費(fèi)市場(chǎng)普及。

基于納豆在心血管疾病防治方面的優(yōu)點(diǎn)，領(lǐng)域內(nèi)專家也一直致力于從事相關(guān)研究，但工作重心還是側(cè)重于挖掘優(yōu)勢(shì)菌種，提高納豆激酶的活性和穩(wěn)定性。同時(shí)結(jié)合中國人的飲食需求，也陸續(xù)開展了部分納豆風(fēng)味改良方面的工作。近年來隨著檢測(cè)分析技術(shù)的進(jìn)步，領(lǐng)域內(nèi)專家針對(duì)納豆的不良風(fēng)味開展了物質(zhì)鑒定工作，以期從根本上改良納豆風(fēng)味，開發(fā)符合中國人口味且富含納豆激酶的產(chǎn)品。基于此，本論文就納豆特有不良風(fēng)味“改良”和“物質(zhì)鑒定”兩方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為納豆在我國的市場(chǎng)推廣奠定理論基礎(chǔ)。

1 納豆風(fēng)味改良

為提高納豆在中國的接受度，改良其風(fēng)味具有重要的研究意義。針對(duì)不良風(fēng)味的產(chǎn)生，研究者的主要關(guān)注點(diǎn)在優(yōu)化和改變發(fā)酵菌種、控制工藝和添加調(diào)味料三個(gè)方面，以彌補(bǔ)納豆風(fēng)味的不足。

1.1 菌種的選擇

1.1.1 篩選優(yōu)良菌株 納豆的不良風(fēng)味是在枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆過程中形成的，菌株之間的個(gè)體化差異會(huì)引起不良風(fēng)味物質(zhì)含量的不同，因而篩選一株優(yōu)良的枯草芽孢桿菌是解決不良風(fēng)味的重要舉措。劉彥敏等[11]從豆醬、豆豉等我國傳統(tǒng)發(fā)酵大豆制品中篩選得到多株枯草芽孢桿菌，均具有發(fā)酵大豆制作納豆和產(chǎn)納豆激酶的能力，同時(shí)獲得了多種品質(zhì)風(fēng)味俱佳的本地化納豆。TAKEMURA等[12]敲除了與支鏈短脂肪酸（Branched-chain short fatty acids，BCFAs）合成相關(guān)的基因，篩選培育風(fēng)味優(yōu)良的枯草芽孢桿菌，緩減了納豆的不良風(fēng)味。

1.1.2 添加風(fēng)味菌株 在枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)上，通過與其他菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵改良風(fēng)味，如乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等產(chǎn)酸菌及毛霉、酵母等真菌[13-15]，其產(chǎn)生的酶類作用于納豆中的不良風(fēng)味物質(zhì)，綜合提升納豆的風(fēng)味品質(zhì)。JHAN等[16]通過枯草芽孢桿菌和保加利亞乳桿菌的共培養(yǎng)，所得產(chǎn)品不僅風(fēng)味良好，還含有抗氧化因子和大量潛在的益生菌。何人可等[17]采用嗜熱鏈球菌對(duì)納豆進(jìn)行二次發(fā)酵，并優(yōu)化了二次發(fā)酵工藝，使得納豆不良風(fēng)味下降。高澤鑫等[15]以發(fā)芽的黃豆為原料，將毛霉擴(kuò)大培養(yǎng)后，再與枯草芽孢桿菌按照一定菌種比混合發(fā)酵，得到的豆豉產(chǎn)品不良風(fēng)味明顯減少。也有研究通過添加釀酒酵母使納豆不良風(fēng)味降低的同時(shí)，還產(chǎn)生淡淡的醇香[18]。可見添加風(fēng)味菌株的混合發(fā)酵可以有效提高納豆的感官品質(zhì)，改善納豆的不良風(fēng)味。

1.2 工藝的控制

1.2.1 調(diào)整原料碳氮比 發(fā)酵原料中含氮量是影響納豆風(fēng)味的決定因素，所以有學(xué)者嘗試通過改變豆類品種或添加外來碳源的方式來改良納豆的風(fēng)味[19]。有研究表明蠶豆中淀粉含量較高，不需要添加碳源，便能實(shí)現(xiàn)高效發(fā)酵，其口感和風(fēng)味均得到了改善[20]，故而，蠶豆、蕓豆、紅豆、鷹嘴豆等豆類逐漸被開發(fā)為新型納豆[20-21]。張杰等[22]將糯米和小黃豆按2:8的比例混合發(fā)酵，有效減少了游離氨的過度產(chǎn)生，改良了納豆風(fēng)味。董岳峰等[23]選擇薏米與大豆搭配發(fā)酵薏米納豆，薏米糖質(zhì)含量比大豆高，調(diào)整了含氮比例，降低了游離氨的同時(shí)也改善了產(chǎn)品口感。因此，采用不同品種的豆類或添加其它富含碳水化合物的雜糧，可實(shí)現(xiàn)高效發(fā)酵，同時(shí)改善其原有風(fēng)味和口感。

1.2.2 優(yōu)化發(fā)酵條件 納豆的營養(yǎng)品質(zhì)和感官風(fēng)味與發(fā)酵工藝直接相關(guān)，在不同工藝條件下可產(chǎn)生極為不同的質(zhì)地與風(fēng)味。工藝優(yōu)化多從大豆前處理、發(fā)酵和后熟三個(gè)階段展開研究，涉及到的工藝環(huán)節(jié)包括原料浸泡時(shí)間、料液比、蒸煮方式及溫度和時(shí)間、接菌溫度、接菌量、發(fā)酵及后熟時(shí)間、儲(chǔ)存溫度和時(shí)間等[19,24]。關(guān)茵等[25]對(duì)原料浸泡的料液比、蒸煮溫度、接菌量及發(fā)酵時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化，以氨氣味為衡量指標(biāo)，獲得了不良風(fēng)味最少的發(fā)酵工藝。也有研究通過增加大豆含水量為60%，調(diào)整大豆厚度為3 cm等條件，降低了納豆中游離氨的產(chǎn)生[26]。通過優(yōu)化上述條件，使菌種保持最佳的生長狀態(tài)，調(diào)控微生物與大豆的互作過程，進(jìn)而影響不良風(fēng)味物質(zhì)的形成，以制作風(fēng)味及納豆激酶等營養(yǎng)功能指標(biāo)均良好的納豆。

1.3 調(diào)味品的添加

1.3.1 鮮食納豆的調(diào)味 為了滿足消費(fèi)者對(duì)口感風(fēng)味以及營養(yǎng)健康的雙重需求，現(xiàn)有納豆主要是通過添加調(diào)味劑和香料等緩和其不良風(fēng)味。主要有兩種添加輔料的方式：一種是在發(fā)酵過程中加入不同的調(diào)味料，如用花椒、十三香、咖喱粉等調(diào)料水浸泡大豆，或者在后熟階段加入食鹽、辣椒、茴香等調(diào)料，不僅有效掩蓋了納豆的不良風(fēng)味，也賦予了其易被消費(fèi)者接受的獨(dú)特風(fēng)味[27]；一種是以新鮮納豆為基礎(chǔ)，附帶粉包或醬包一起銷售，涉及調(diào)味品（芥末、咖喱、孜然等）、調(diào)味醬（芝麻醬、糖豆醬、辣椒醬等）以及果醬（芒果、藍(lán)莓、草莓等），食用時(shí)攪拌均勻即可[26,28]，按自己喜好調(diào)制口味各異的風(fēng)味鮮食納豆。

1.3.2 鮮食納豆的深加工 隨著冷藏時(shí)間的延長，鮮食納豆的活菌數(shù)及部分生物活性物質(zhì)均有所降低，口感和風(fēng)味也會(huì)逐漸下降，有研究證明冷藏3 d是其最佳食用時(shí)間[29]，冷藏時(shí)間較短，嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的接受度和市場(chǎng)的銷售。因此，衍生出經(jīng)過干燥、粉碎深加工后制得的納豆系列產(chǎn)品，以納豆烘干粉和納豆凍干粉為主，既能避免其在冷藏過程中由于菌株代謝出現(xiàn)不良風(fēng)味加重的現(xiàn)象，又能延長保質(zhì)期[30]，納豆粉可以用合適溫度的熱水直接沖調(diào)飲用[31]；也可以結(jié)合膠囊和壓片工藝，復(fù)配木糖醇、甘露醇、奶粉等多種輔料，開發(fā)不同系列的納豆膠囊和納豆糖果、奶片等咀嚼片[32-33]；又或者研制成中國人喜愛的糕點(diǎn)，搭配綠茶粉、木糖醇、海藻糖、食用油，加工成茶香納豆糕[34]，更貼合中國消費(fèi)者的飲食習(xí)慣和口味偏好。

2 納豆不良風(fēng)味物質(zhì)鑒定

雖然大豆原料自身帶有豆腥味，包括1-辛烯-3-醇、己醛、2-戊基呋喃等化合物[35-36]，但是發(fā)酵可以有效降低豆制品的豆腥味，賦予其新的感官風(fēng)味[37]。因此，納豆不良風(fēng)味源于微生物與大豆的互作，并有學(xué)者證明在蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)會(huì)降解為小肽和氨基酸，但氨基酸會(huì)進(jìn)一步降解產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)[38]。不斷有研究分析并鑒定納豆中不良風(fēng)味物質(zhì)，主要是異丁酸甲酯、氨、2-甲基丁酸、吡嗪等揮發(fā)性化合物[39-40]。近年來，LIU等[41]研究表明 2,5-二甲基吡嗪，2,3,5-三甲基吡嗪，2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-甲基-6-乙基吡嗪對(duì)納豆風(fēng)味有很大貢獻(xiàn)。KEITAROU等[42]研究證明異戊酸、三甲基吡嗪對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵食品的風(fēng)味有很大貢獻(xiàn)。HONG等[43]認(rèn)為在納豆發(fā)酵過程中，合成的異丁酸和異戊酸引起了納豆中難聞的氣味。因此，納豆中不良風(fēng)味物質(zhì)主要?dú)w類為游離氨、吡嗪和BCFAs，這些物質(zhì)均與氨基酸代謝有關(guān)，例如，谷氨酸和精氨酸等涉及游離氨的釋放[44]，絲氨酸和蘇氨酸等涉及吡嗪的形成[45]，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸是支鏈醛和BCFAs的前體化合物[46]。

2.1 游離氨

游離氨是一種有刺激性臭味的氣體，類似于臭雞蛋和蔬菜腐敗的味道，也是納豆中公認(rèn)的不良風(fēng)味。枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)游離氨的主要途徑是聯(lián)合脫氨基作用和轉(zhuǎn)氨作用，而非脫羧作用[47]。已有學(xué)者證實(shí)，枯草芽孢桿菌的產(chǎn)游離氨代謝至少與5種氨基酸有關(guān)[48]：在蛋白酶的作用下，精氨酸分解轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，同時(shí)生成尿素，再經(jīng)尿素酶降解產(chǎn)游離氨；同樣，天冬酰胺由酶催化產(chǎn)生天冬氨酸并釋放游離氨，在天冬氨酸酶催化下繼續(xù)產(chǎn)生延胡索酸和游離氨。然而，枯草芽孢桿菌產(chǎn)氨主要是通過谷氨酸代謝，谷氨酸脫氫酶（GDH）是整個(gè)代謝的關(guān)鍵酶，在該菌株內(nèi)，GDH由rocG基因和gudB基因編碼，致力于谷氨酸的降解，同時(shí)產(chǎn)生游離氨，不參與谷氨酸的合成[49]，并且在氮源豐富的發(fā)酵基質(zhì)下，編碼GDH的rocG基因很活躍[50]，因此，游離氨確為引起納豆不良風(fēng)味的物質(zhì)，也印證了“發(fā)酵原料中含氮量的差異和菌種之間的個(gè)體差異會(huì)產(chǎn)生不同程度氨臭味的納豆產(chǎn)品”的事實(shí)。

2.2 吡嗪類化合物

吡嗪是傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)者，可以促進(jìn)食品的整體香氣，如中國白酒，及以大豆和可可豆為基礎(chǔ)的發(fā)酵食品，主要為2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪[51]。GC-O嗅聞分析中對(duì)2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪的風(fēng)味整體描述為“焙烤味、堅(jiān)果味、霉味和泥土味”[52]，該類化合物閾值較低，在其含量較低的情況下就能呈現(xiàn)優(yōu)良風(fēng)味，含量過高可能會(huì)呈現(xiàn)“霉味、泥土味”等不良風(fēng)味[53]，因而，極可能由于2,5-二甲基吡嗪在納豆中合成量過多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其閾值而引起納豆制品產(chǎn)生不愉快氣味。CHRISTIAN等[45]已明確枯草芽孢桿菌中2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪的主要合成途徑，主要涉及蘇氨酸的合成與降解（圖1）。天冬氨酸代謝合成蘇氨酸，經(jīng)L-蘇氨酸-3-脫氫酶（TDH）催化產(chǎn)生氨基丙酮，通過氧化、環(huán)化等非酶促反應(yīng)生成2,5-二甲基吡嗪，而氨基丙酮還可以代謝生成丙酮酸，通過縮合生成α-乙酰乳酸，再脫羧產(chǎn)生乙偶姻，進(jìn)而被分泌到胞外，和游離氨發(fā)生非酶促反應(yīng)，生成四甲基吡嗪[54]。整個(gè)發(fā)酵體系在不添加任何前體物質(zhì)（蘇氨酸、乙酰丙酮）的前提下，主要存在2,5-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪，幾乎沒有四甲基吡嗪，2,3,5-三甲基吡嗪的合成機(jī)制與2,5-二甲基吡嗪類似[55]；此外，氧氣的有效利用，會(huì)引起吡嗪類化合物的過量合成[34]，枯草芽孢桿菌是一種好氧菌，發(fā)酵體系內(nèi)氧氣充足的時(shí)候代謝加速，可能引起了納豆中吡嗪類化合物大量聚集，進(jìn)而使納豆產(chǎn)生風(fēng)味劣變。

圖1 2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪合成的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways for the synthesis of 2,5-dimethylpyrazine and tetramethylpyrazine

2.3 支鏈短脂肪酸

支鏈短脂肪酸（BCFAs）一般是碳原子數(shù)小于6的有機(jī)脂肪酸，主要包括異丁酸、異戊酸、異己酸、2-甲基丁酸等。GC-O嗅聞分析中對(duì)異戊酸等BCFAs的風(fēng)味描述為“銀杏果臭味、酸味、刺激的酸敗味”[56]，佐證了BCFAs與納豆的不良風(fēng)味有關(guān)。BCFAs主要通過支鏈氨基酸的分解代謝產(chǎn)生，即亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸，該代謝通路涉及的合成基因和關(guān)鍵酶在不同種屬微生物中差異較大。在枯草芽孢桿菌內(nèi)，β-酮酰基-酰基載體蛋白合酶III（FabH）是合成BCFAs的關(guān)鍵酶[57]，此外，支鏈α-酮脫氫酶復(fù)合物（BCKDC）也被證實(shí)為BCFAs合成代謝途徑的一種關(guān)鍵限速酶[58]。但在不同的枯草芽孢桿菌中其合成的關(guān)鍵基因和表達(dá)差異極為顯著，因此支鏈氨基酸對(duì)不良風(fēng)味的貢獻(xiàn)與菌株本身有一定的相關(guān)性。

3 應(yīng)用與展望

目前預(yù)防和治療心血管疾病的納豆產(chǎn)品越來越受到關(guān)注，但由于其特有的不良風(fēng)味，仍然不能被我國人群廣泛接受。因此，采用合適的風(fēng)味改良方式暫時(shí)緩解納豆風(fēng)味問題，如改變發(fā)酵菌種、優(yōu)化工藝等，以初步滿足中國人食用納豆的基本需求，是納豆進(jìn)入我國市場(chǎng)的重要舉措。但是，從根本上明確納豆不良風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)及其產(chǎn)生途徑，是有效控制和消除納豆不良風(fēng)味的根本所在。隨著多組學(xué)分析技術(shù)及遺傳操作手段的發(fā)展，使得解決上述問題并通過靶向控制發(fā)酵過程中不良風(fēng)味物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控成為可能。可見，納豆產(chǎn)品中風(fēng)味的定向改良具有很好的發(fā)展前景。