西洋參枳椇子配伍對急性酒精性肝損傷的保護作用

李志滿，臧愛梅，沙紀越，李珊珊，孫印石,

（1.中國農業科學院特產研究所, 吉林長春 130112；2.高密市農業農村局, 山東濰坊 261500）

西洋參（American ginseng，AG）為五加科植物西洋參（PanaxquinquefoliumLinn.）的干燥根，具有補氣養陰、清熱生津的功效[1]。西洋參主要活性成分為人參皂苷和多糖成分[2-3]，已被證明具有抗抑郁[4]、抗腫瘤[5]、提高機體免疫力[6]、降血糖[7]和抗肥胖[8]等多種生物活性。有研究證明西洋參可消除小鼠脂肪肝、減少肝臟和腸道脂蛋白分泌，降低脂質循環水平，逆轉代謝綜合征[9-10]。枳椇子（Hovenia dulcisThunb）為鼠李科拐棗屬植物枳椇的種子，具有解酒毒、止嘔、清熱利尿等功效。近年來，中藥配伍類解酒制品紛紛涌向市場，主要成分以葛根、葛花和枳椇子為主，如食源復方解酒口服液、葛根解酒方、葛根-枳椇子解酒組合物等復方解酒口服液[11]。其中枳椇子常被用于解酒護肝產品開發中[12-14]。在2018年西洋參被衛健委批準為既是藥品又是食品，引起了大家對西洋參的廣泛關注。西洋參的特別之處在于補而無燥，常作為滋陰補腎中藥出現在復方當中。基于西洋參與枳椇子的藥效作用，本研究將西洋參與枳椇子進行配伍組合治療酒精性肝損傷。

幾十年來，醫治酒精性肝損傷（ALD）仍未找到特效藥物，因此，開展中藥配伍理論的研究思路可能是治療疾病的新方向。本研究通過預防灌胃小鼠組合物后建立急性酒精性肝損傷模型，檢測小鼠血清中生化指標變化和抗氧化應激能力，觀察肝臟病理組織病變程度和MAPK信號通路的變化。首次將西洋參與枳椇子配伍后探討其對酒精性肝損傷的作用，為西洋參的開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級ICR健康雄性小鼠50只，體重為20～22 g 遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證SCXK（遼）2015-0001，合格編號211002300023526；西洋參 吉林省撫松縣；枳椇子 山東濟南秦越人農業發展有限公司；天冬氨酸氨基轉移酶（Aspartateaminotransferase，AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、甘油三酯（Triglyceride，TG）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試 劑 盒、谷 胱 甘 肽（Glutathione，GSH）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、BCA法總蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木素染液和伊紅染液 Sigma-Aldrich公司；中性樹膠

索萊寶生物科技有限公司，RIPA（Radio-Immunoprecipitation assay）裂解緩沖液 Bio-world公司，BCA試劑盒 碧云天生物技術有限公司；化學發光試劑盒 美國密理博公司；phospho-ERK（p-ERK）、phospho-JNK（p-JNK）、phospho-P38（p-P38） 美國Santa cruz生物技術公司；GAPDH和二抗（鼠抗lgG） 美國Abcam公司。

Heraeus Megafuge 8R型超高速冷凍離心機賽默飛世爾科技有限公司；IX51型顯微鏡 奧林巴斯公司；Epoch2型酶標儀 美國博騰儀器有限公司；MS204S型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；EG1150型生物組織包埋機、RM2265型切片機、HI1210型水浴鍋、HI1220型烘片儀 徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司；Alpha2-4LD plus真空冷凍干燥機 德國Christ公司；ChemiDocTMMP型全能成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西洋參枳椇子提取物的制備 將西洋參和枳椇子放置于電熱恒溫鼓風干燥箱中，在60 ℃條件下干燥12 h，分別按質量比1:1、2:1和1:2混合，將干燥的混合物粉碎，過60目篩網，向混合物中加入重量比為8倍量蒸餾水，浸泡1 h，回流提取1 h，然后以5000 r/min，離心10 min，獲得上清液；再向殘渣中加入按重量比為5倍量蒸餾水，回流提取0.5 h，離心，獲得上清液[11]，合并兩次上清液，將三種水煎液放置于-80 ℃條件下冷凍4 h后，真空冷凍干燥，即為組合物Ⅰ、組合物Ⅱ和組合物Ⅲ，產率分別為16.7%、19.3%和16.75%，產率（%）=提取物干燥后重量（g）/生藥重量（g）。

1.2.2 動物分組與給藥方法 ICR小鼠在控溫（22±3）℃，相對濕度為（55%±15%）環境中飼養，自由進食、飲水適應1周后，隨機分為五組，即為正常組、模型組、組合物Ⅰ組、組合物Ⅱ組和組合物Ⅲ組。西洋參枳椇子組合物組以100 mg/kg·bw劑量連續灌胃小鼠14 d，正常組及模型組給予生理鹽水。各組在最后一次給予受試物30 min后，除正常組外，24 h內灌胃小鼠3次酒精（5 g/kg），酒精灌胃結束間隔6 h后，取血，麻醉處死小鼠，分離肝臟[15]。

1.2.3 血液和組織樣本采集 末次給予酒精6 h后，取血后，麻醉處死，分離肝臟，選取左葉常溫保存于福爾馬林中，其余肝臟保存于-80 ℃。將血液室溫靜置30 min，在4 ℃，以1000 r/min離心30 min，分離血清，保存于-80 ℃。

1.2.4 生化指標檢測 血清中AST、ALT和TG水平與肝組織中GSH-Px、SOD、GSH試劑盒和MDA試劑盒指標檢測按照試劑盒提供的說明書進行規范操作。

1.2.5 肝臟病理學檢測 將固定肝組織標本切取厚度不超過0.5 cm小塊置于包埋盒中，用自來水沖洗24 h，經由低濃度到高濃度酒精脫水，用溶于石蠟的透明劑二甲苯透明后，浸蠟包埋。用蠟塊固定在旋轉切片機上，切成5 μm厚度薄片，溫水展開貼在載玻片上。將切片進行蘇木精和伊紅（H&E）染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.2.6 蛋白印記檢測肝組織中蛋白的表達 運用BCA法測定細胞蛋白濃度，將SDS-PAGE（10%～12%）分離凝膠分離等量的蛋白樣品，轉移到PVDF膜上，然后封閉1 h，經p-ERK、p-JNK、p-P38和GAPDH一抗孵育，4 ℃條件下放置過夜，然后使用酶標二抗室溫孵育1 h。將A和B試劑等體積混合，PVDF膜與混合液充分接觸，在全能型成像系統中曝光。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 西洋參枳椇子組合物對小鼠血清轉氨酶的影響

AST主要分布在肝細胞細胞質和線粒體中，ALT主要分布在細胞質中，肝細胞損傷后釋放到血液，兩種轉氨酶活性增加，血液中AST和ALT酶水平可以作為肝損傷信號，反映肝臟受損情況[16]。如圖1所示，與正常組相比，模型組中ALT和AST活力極顯著升高（P＜0.01），表明酒精引起小鼠肝細胞損傷，轉氨酶活力升高；與模型組相比，西洋參枳椇子組合物Ⅰ極顯著降低ALT活力（P＜0.01）且顯著降低AST水平（P＜0.05），西洋參枳椇子組合物Ⅱ、Ⅲ極顯著降低ALT和AST活力（P＜0.01），西洋參給藥組間無顯著性差異。血清中轉氨酶的活力下降，說明西洋參枳椇子組合物具有保護肝細胞的作用。

圖1 西洋參枳椇子組合物對小鼠血清ALT（A）和AST（B）活力的影響Fig.1 Effect of AGH on on the activities of serum ALT and AST in mice

2.2 西洋參枳椇子組合物對血清中甘油三酯的影響

甘油三酯由肝臟合成，是脂肪酸在人體內儲存和運輸的主要形式，過量攝入酒精可以使肝臟中甘油三酯積累，引起肝臟脂質代謝異常[17]。與正常組相比，模型組小鼠血清中TG含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，組合物Ⅰ、Ⅱ組顯著降低小鼠血清中TG含量（P＜0.05），組合物Ⅲ極顯著降低TG含量（P＜0.01），各組間無顯著性差異。結果表明組合物能夠降低小鼠血清脂類物質水平(圖2)。

圖2 西洋參枳椇子對小鼠血清TG含量的影響Fig.2 Effect of AGH on on the content of serum TG in mice

2.3 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝組織抗氧化能力的影響

酒精在肝臟被酒精脫氫酶轉化為有害物質乙醛，乙醛隨后被醛脫氫酶代謝為乙酸，在代謝過程中可以促進自由基如活性氧（ROS）產生，進而引起脂質過氧化[18]。此外，過量ROS導致脂質過氧化產物MDA產生，使抗氧化劑水平降低，導致氧化還原平衡失調[19]。肝細胞內含有內源性抗氧化酶，SOD和GSH-Px可以維持氧化應激穩態，但酒精攝入增加活性氧水平，影響抗氧化酶水平，從而導致肝臟損傷[20]。實驗結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝組織內抗氧化酶SOD、GSH-Px活力極顯著降低（P＜0.01），還原型GSH含量極顯著降低（P＜0.01）和MDA含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，組合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ極顯著升高了SOD、GSH-Px活力（P＜0.01）和GSH水平（P＜0.01），極顯著降低MDA含量（P＜0.01）。組 合物Ⅱ中GSH-Px、SOD活力 和GSH含量極顯著高于組合物Ⅰ，具有顯著性差異（P＜0.01），同時GSH-Px和SOD活力也高于組合物Ⅲ，但無統計學差異；組合物Ⅱ中MDA含量極顯著低于組合物Ⅰ（P＜0.05），低于組合物Ⅲ，但無統計學差異。由此可說明組合物Ⅱ抗氧化能力高于組合物Ⅰ和組合物Ⅲ，結果提示該組合物明顯改善小鼠肝組織中酒精引起的氧化應激情況(圖3)。

圖3 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝組織中SOD（A）、GSHPx（B）活性和GSH（C）、MDA（D）含量的影響Fig.3 Effects of AGH on SOD, GSH-Px activity and GSH,MDA content of liver tissue in mice

2.4 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝臟病理的影響

肝臟病理組織H&E染色結果顯示，正常組小鼠肝細胞排列整齊，形態正常，未出現明顯變性、壞死；模型組小鼠肝組織中細胞間出現大量白色脂滴和炎性細胞浸潤情況，說明酒精引起肝細胞中脂質代謝異常；西洋參枳椇子組中小鼠肝細胞排列逐漸緊密、脂滴數量逐漸減少并且炎性浸潤程度減輕，說明組合物具有改善脂質代謝和抗炎的作用(圖4)。

圖4 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝組織病理形態（蘇木精-伊紅染色，400×）Fig.4 Liver pathomorphology in different groups（H & E Staining, 400×）

2.5 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝臟MAPK信號通路的影響

與正常組相比，模型組中p-ERK，p-JNK和p-P38的水平明顯增加（P＜0.01），組合物，組合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ極顯著降低p-ERK、p-JNK和p-P38的表達（P＜0.01）。結果表明，西洋參枳椇子組合物可能抑制ERK、JNK和P38的磷酸化從而減輕肝細胞凋亡(圖5)。

圖5 西洋參枳椇子組合物對MAPK信號通路中p-JNK、p-P38、p-ERK的影響Fig.5 Effects of AGH on p-ERK，p-JNK and p-P38 in MAPK signaling pathway

3 結論

肝臟是藥物代謝和解毒功能的重要器官，日常生活中過量飲酒或服用藥物都會引發肝臟的損傷[21-22]。肝細胞中儲存了大量血清轉氨酶AST和ALT，當細胞膜受損時，膜通透性增加，胞內大量AST、ALT擴散到血液中，以AST、ALT水平高低判斷肝細胞是否損傷[16]。而且在ALD早期發病機理研究表明，酒精進入機體后，乙醇可影響脂肪代謝，導致TG在肝細胞內沉積，大量蓄積導致病變[23-24]。酒精經酶代謝時，能夠誘導細胞內產生ROS，消耗大量還原性物質如GSH，從而無法清除過多自由基，引起氧化應激，導致細胞脂質過氧化產物迅速增加，肝細胞膜受損[25]。因此GSH多少是衡量抗氧化能力重要因素[26]，MDA含量可以反映過氧化損傷和細胞受損程度[18]。

ALD早期損傷多可逆轉，如及時進行針對性治療可防止發展到肝硬化、肝癌等疾病，有效預防與治療ALD已成為醫藥與功能性食品領域研究熱點，并且研究證明食藥同源天然產物具有較好預防保護酒精性肝損傷的作用[27]。因此，本實驗采用食藥同源西洋參和枳椇子組合物，通過西洋參與枳椇子配伍后提取出有效成分，并發現其對酒精性肝損傷具有保護作用，其作用機制可能與改善脂質代謝、提高抗氧化能力和抑制MAPK信號通路活化有關，這一結果為西洋參與枳椇子配伍應用提供了理論基礎。