水豆豉發酵前后理化特性變化及其提取物對前列腺癌細胞抑制作用的初探

游 蘭，董 科，羅若城，何 迅，羅姝菡，陳嘉熠，裴曉方

（四川大學華西公共衛生學院(華西第四醫院), 四川成都610041）

水豆豉（Shuidouchi, SDC），一種中國傳統的發酵豆制品，具有獨特的風味與較高的營養價值。在微生物發酵過程中，大豆蛋白被分解成小分子的氨基酸和多肽，以及發酵后的總酸、pH、還原糖等理化特性是評價水豆豉成熟和營養價值的主要參考指標。此外，發酵后的大豆中大豆異黃酮、大豆皂苷、豆豉溶纖酶等生物活性成分的存在，進一步增加了大豆發酵產物的保健功能[1]。迄今為止，我國水豆豉的生產多以自然發酵為主[2]，因而發酵微生物種類不受人為控制，從而無法保證市售水豆豉的營養價值和品質，存在一定的食用安全隱患。因此，通過單菌發酵水豆豉，并研究其發酵后的生物活性物質、理化特性、抗氧化能力，對保障并提高水豆豉食用的安全性尤為重要，且目前對單菌發酵水豆豉類似的相關研究鮮有報道。

已有研究證實發酵大豆的主要活性成分是大豆異黃酮[3]，具有抗自由基、抗氧化、抗溶血、抗腫瘤等生物活性，其抗腫瘤活性受到國內外學者的廣泛關注，主要表現在抗乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌等方面[4-6]。前列腺癌是一類雄激素依賴性腫瘤，目前雄激素剝奪治療是一線治療方法，但只在前列腺癌早期有效，大多數患者在治療14～30個月后，腫瘤局部復發，同時對內分泌治療產生抵抗，進而便進入“去勢抵抗”階段，發展成為去勢抵抗前列腺癌（castrationresistant prostate cancer, CRPC）[7-8]，且CRPC患者的生存期通常小于24個月。目前，在前列腺癌的治療中除了雄激素剝奪療法，還主要有化療和放射治療。當疾病發展成為CRPC后，這些方法都存在起效慢、副作用大等缺點，因此，尋找安全有效的抗CRPC策略成為亟待解決的公共衛生問題。國內外學者在這方面不斷探索，特別是近年來有研究提示[9-10]，膳食中攝入大豆異黃酮能夠降低罹患前列腺癌的風險，并且流行病學研究也證實[11]，亞洲人群前列腺癌的低發生率與膳食中豆類食品或豆制品的較高攝入量相關。生活方式中膳食的調節作用越來越引起人們的關注，所以，通過食療的方式預防并延緩CRPC發生與發展具有重要的應用價值。同時，尋找一種富含大豆異黃酮的食品也成為研究CRPC的熱點。水豆豉，作為富含大豆異黃酮的發酵豆制品，是否能抑制前列腺癌的發生與發展，目前還未見報道。

因此，本研究采用從市售水豆豉中篩選出的3株高產蛋白酶菌株發酵黃豆，測定發酵前后氨基酸態氮、總酸、pH、還原糖含量變化，比較6種大豆異黃酮、總酚、總黃酮含量和抗氧化能力的差異，并初步探討水豆豉提取物對人去勢抵抗前列腺癌細胞Vcap、22RV1的抑制作用。一方面，為水豆豉的保健功能價值評價提供了一定的實驗數據；另一方面，為水豆豉相關健康產品的研發、以及深入探討水豆豉抗前列腺癌可能的分子機制提供實驗依據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株和細胞株 選擇從市售水豆豉中篩選出的3株高產蛋白酶菌株，編號為B19、B20、B61，經鑒定，B19和B20菌株為枯草芽孢桿菌，B61菌株為貝萊斯芽孢桿菌[12-13]；人去勢抵抗前列腺癌細胞（Vcap） 中國科學院上海細胞庫；人正常前列腺上皮細胞（RWPE-1）和人去勢抵抗前列腺癌細胞（22RV1） 重慶醫科大學生命科學院感染實驗室贈送；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法、FRAP法）上海碧云天生物技術有限公司；DPPH、Hoechst染色試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；人特異性抗原（PSA）、人睪酮（T）、人二氫睪酮（DHT）ELISA檢測試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司

6種大豆異黃酮標準品（大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、大豆黃素、染料木素、黃豆黃素） 成都德思特生物科技有限公司；綠原酸標準品、蘆丁標準品大連美侖生物技術有限公司；UltiMate3000 HPLC儀（色譜柱RPC18柱：柱長250 nm，柱內徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm） 美國戴安公司；multiskan GO 1510全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；ECLIPSE Ti熒光倒置顯微鏡 日本尼康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水豆豉的制備 水豆豉的制備如流程圖1所示，具體操作要點如下。挑選：選擇完整、均勻大小的黃豆，除去腐爛、發霉的黃豆和其他雜質。

圖1 水豆豉制備流程圖Fig.1 Flowchart of preparation of Shuidouchi

浸泡：稱取30 g黃豆于250 mL錐形瓶中，加入90 mL蒸餾水后浸泡12 h。瀝干水后稱量，并記錄黃豆濕重重量。

蒸煮：將瀝干后的黃豆置于高壓蒸汽滅菌鍋內121 ℃高壓30 min。

接種菌液：蒸熟黃豆待自然冷卻后接種B19、B20、B61菌株菌液，接菌量為3.00%。

恒溫發酵：接種菌液搖勻后置于35 ℃恒溫培養箱中培養，發酵時間為4 d，將其他條件相同，不加入菌液發酵的黃豆（蒸熟黃豆）作為對照組。

1.2.2 理化特性的測定 氨基酸態氮、總酸、pH、還原糖的測定方法分別參照國家標準《GB 5009.235-2016 食品中氨基酸態氮的測定》[14]、《GB 12456-2008 食品中總酸的測定》[15]、《GB 5009.237-2016 食品pH的測定》[16]、《GB 5009.7-2016 食品中還原糖的測定》[17]。

1.2.3 大豆異黃酮的測定 參照國家標準GB/T 26625-2011《糧油檢驗大豆異黃酮含量測定高效液相色譜法》進行測定[18]。檢測指標包括大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷、大豆黃素、染料木素、黃豆黃素6種大豆異黃酮類物質。

1.2.4 總酚、總黃酮及抗氧化能力的測定

1.2.4.1 水豆豉提取物中總酚含量的測定 參照HE等[19]的實驗方法，用蒸餾水將綠原酸標準品配制成1 mg/mL的儲備液，再將其稀釋成0.00～0.20 mg/mL標準溶液，將不同濃度的綠原酸標準溶液和提取物溶液混合，依次經福林酚試劑、20%碳酸鈉溶液處理后于760 nm處測定吸光度值，以標準品綠原酸濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作標準曲線計算水豆豉提取物中總酚含量。

1.2.4.2 水豆豉提取物中總黃酮含量的測定 參照勞佳麗等[20]的實驗方法，用70%乙醇將蘆丁標準品配制1 mg/mL的儲備液，再將其稀釋成0～200 μg/mL蘆丁標準溶液，以不同濃度的蘆丁標準溶液和提取物溶液混合，依次經5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液處理后于510 nm處測定吸光度值，以蘆丁標準品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作標準曲線計算水豆豉提取物中總黃酮含量。

1.2.4.3 抗氧化能力的測定 參照ERCAN等[21]的實驗方法，用蒸餾水將10 mmol/L Trolox標準溶液稀釋至0～2.0 mmol/L，取不同濃度標準系列溶液及提取物溶液經DPPH 乙醇溶液處理后，混勻后避光放置30 min，于517 nm處測定吸光度值；ABTS自由基陽離子清除實驗按照試劑盒操作說明進行測定，以Trolox標準品濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，制作標準曲線計算水豆豉提取物清除DPPH和ABTS自由基的能力；FRAP法總抗氧化能力測定實驗按照試劑盒操作說明進行測定，以FeSO4·H2O標準品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作標準曲線測定總抗氧化能力。

1.2.5 水豆豉提取物對CRPC細胞的抑制作用

1.2.5.1 水豆豉提取物制備 在本課題組前期確定的水豆豉純種發酵的最優條件下[22]，即采用B19菌株發酵、發酵溫度40 °C、發酵時間4 d、接菌量3.00%。稱取最優條件下發酵的黃豆發酵物，置于超聲波清洗器中60 ℃提取30 min，重復2次提取，合并提取液，用布氏漏斗抽濾后，濃縮蒸發溶解后，得到1 g/mL（以提取物凈重計）的黃豆發酵提取物，過0.22 μm濾膜，分裝后于-80 ℃保存。

1.2.5.2 細胞培養 DMEM完全培養液（含5%胎牛血清、1%青、鏈霉素）用于培養Vcap細胞、RPMI-1640培養液（含5%胎牛血清、1%青、鏈霉素）用于培養RWPE-1和22RV1細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。

1.2.5.3 水豆豉提取物作用濃度及時間篩選 對數生長期的Vcap、22RV1及RWPE-1細胞制成細胞懸液，將細胞數調節至5×104個/mL后接種于96孔板，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養12 h。水豆豉提取物設置為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 mg/mL系列濃度，同時設置空白組（只含完全培養基）和對照組（只含細胞和完全培養基），于37 ℃，5% CO2培養箱中培養12、24、48 h。CCK8法測定細胞存活率，細胞存活率（%）=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100，根據結果篩選出對正常細胞RWPE-1無明顯毒性的水豆豉提取物作用濃度和時間。

1.2.5.4 Hoechst染色觀察CRPC細胞形態 根據篩選出水豆豉提取物的有效濃度和作用時間，對干預后的Vcap、22RV1細胞進行Hoechst染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.2.5.5 ELISA檢測培養基中PSA、DHT及T的含量 對PSA、T及DHT含量的檢測，參照PSA、DHT及T ELISA檢測試劑盒操作說明書進行。

1.3 數據分析

組間對比采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNKq檢驗，均采用雙側檢驗，當P＜0.05時，差異具有統計學意義，所有數值均由均數±標準差（Mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 水豆豉發酵前后理化特性與活性成分的變化

2.1.1 理化特性分析 樣品中氨基酸態氮、總酸、pH、還原糖的測定含量如表1所示。B19、B20、B61號菌株發酵的水豆豉中氨基酸態氮、總酸、還原糖含量均高于蒸熟黃豆，其中B19號菌株發酵的水豆豉中氨基酸態氮、還原糖含量最高。B19菌株發酵水豆豉的氨基酸態氮含量最高（7.76 g/kg），高于同屬細菌發酵的日本納豆中平均氨基酸態氮含量（6.0 g/kg）[23]，但低于曲霉發酵的瀏陽豆豉中氨基酸態氮（13.7 g/kg）[24]，這可能與發酵選用菌種及其產蛋白酶特性有關[25]。樣品均為弱酸性或中性，其pH大小差異無統計學意義（P＞0.05），本研究發酵品總酸的含量均低于別的產品，可能由發酵不完全導致。

表1 樣品中理化成分的檢測結果Table 1 Test results of physicochemical components in samples

2.1.2 大豆異黃酮變化分析 根據國標方法測定水豆豉中大豆異黃酮含量，6種大豆異黃酮色譜峰形及分離效果較好，如圖2所示，方法的靈敏度和特異度均滿足實驗要求，加標回收實驗結果顯示回收率均在（100%±10%）之間。樣品中6種大豆異黃酮均有檢出，含量如圖3所示。總大豆異黃酮的比較如圖4所示，B19、B20、B61號菌株發酵的水豆豉中總大豆異黃酮均高于蒸熟黃豆，三株菌中，B19號菌株發酵的水豆豉中總大豆異黃酮含量最高。發酵水豆豉中總大豆異黃酮總含量均＞1000 mg/kg，高于其他豆類食品（嫩豆腐、腐乳等）（100～600 mg/kg）[26]。但值得注意的是，與其他研究報道的發酵豆豉如永川豆豉、瀏陽豆豉不同[27]，這些豆豉在發酵過程中其總大豆異黃酮含量呈下降趨勢，提示發酵菌種和加工工藝等因素對豆豉的營養活性成分有重要的影響[28]。

圖2 6種大豆異黃酮色譜圖Fig.2 Chromatogram of 6 soybean isoflavones

圖3 樣品中6種大豆異黃酮含量的比較Fig.3 Comparison of isoflavones contents of 6 soybean isoflavones in samples

圖4 不同樣品中總大豆異黃酮含量的比較Fig.4 Comparison of total soybean isoflavones in different samples

2.1.3 總酚、總黃酮含量分析 不同菌株發酵水豆豉總酚、總黃酮測定實驗結果見表2。B19、B20、B61號菌株發酵后總黃酮含量均高于蒸熟黃豆，三株菌中B19、B61菌株發酵后總黃酮含量高于B20號；總酚含量測定顯示，B19、B61號菌株發酵后總酚均高于蒸熟黃豆，其中B19號菌株發酵后總酚含量最高。

表2 不同菌株發酵水豆豉的總酚、總黃酮含量結果Table 2 Experimental results of the contents of total phenols and flavonoids in SDC fermented by different strains

2.1.4 抗氧化能力的測定 FRAP實驗，DPPH、ABTS自由基清除實驗結果如表3所示。B19、B61號菌株發酵的水豆豉抗氧化能力均強于蒸熟黃豆；而B20號菌株發酵后水豆豉DPPH自由基清除能力與蒸熟黃豆相比無統計學差異。發酵后總酚、總黃酮含量及抗氧化能力明顯提高，而抗氧化能力的提高可能與發酵后總酚含量增加，或是與增加的游離氨基酸和多肽相關[29]。后者提示發酵過程中游離氨基酸和多肽的增加或對豆制品抗氧化活性提升具有重要意義。但在不同豆制品理化特性與活性成分的比較中，大豆種類、發酵菌種、加工工藝等因素的影響是多樣性的，需綜合評價。

表3 不同菌株發酵水豆豉抗氧化能力實驗結果Table 3 Experimental results of antioxidant capacity of SDC fermented by different strains

2.2 B19菌株發酵水豆豉提取物對CRPC細胞的抑制作用

2.2.1 提取物中大豆異黃酮的測定 水豆豉提取物中大豆異黃酮的含量如圖5所示，6種大豆異黃酮均有檢出，總大豆異黃酮含量為（1713.25±75.38） mg/kg（以黃豆干重計）。其中，在糖苷型中，大豆苷含量最高，為（711.15±35.21） mg/kg；在苷元型中，染料木素含量最高，為（86.17±25.17） mg/kg。

圖5 SDC提取物中6種大豆異黃酮含量Fig.5 Contents of 6 soybean isoflavones in SDC extracts

2.2.2 提取物作用濃度及時間篩選 作用時間為12、24、48 h時，RWPE-1、22RV1和Vcap細胞的存活率均隨提取物濃度增大而降低，呈現劑量-反應關系。在不同作用時間、濃度下，細胞存活率：RWPE-1＞Vcap＞22RV1細胞。當作用濃度為64 mg/mL時，三種細胞存活率均低于2%。22RV1細胞隨著作用時間的增加，細胞存活率逐漸降低，呈現出時間-反應關系；而RWPE-1和Vcap細胞在作用濃度大于2 mg/mL時呈時間-反應關系，在作用濃度小于2 mg/mL時，細胞存活率反而隨作用時間的增加而有上升趨勢。因此，為保證水豆豉提取物對前列腺正常細胞RWPE-1無明顯損傷作用，又能保證對前列腺癌細胞22RV1和Vcap細胞的殺傷作用，故選擇水豆豉提取物濃度為2、4、8 mg/mL，作用時間為24 h進行后續實驗(圖6)。

圖6 不同作用時間細胞的存活率Fig.6 Cell survival rate at different time of treatment

2.2.3 提取物對CRPC細胞形態的影響 經篩選出的2、4、8 mg/mL水豆豉提取物干預22RV1和Vcap細胞24 h后，Hoechst染色對CRPC細胞進行凋亡檢測，于倒置熒光顯微鏡下觀察實驗結果，如圖7所示。隨著作用濃度的增加，凋亡細胞明顯增多，且凋亡細胞的細胞核呈致密濃染或呈塊狀致密濃染，并可見凋亡小體。提示其對22RV1、Vcap細胞具有選擇性殺傷作用，并能促進細胞凋亡。細胞的增殖是通過周期來實現的，而調控細胞周期主要依靠細胞周期蛋白和周期素依賴性激酶，其過表達導致腫瘤的發生。李飛等[30]的研究表明，染料木黃酮能抑制周期蛋白的表達，且能阻滯CRPC細胞于G2/M期，從而抑制細胞進行分裂，最終導致細胞凋亡。而細胞凋亡可能是抑制細胞增殖的原因之一，細胞凋亡在抑制腫瘤發展中起重要作用。提示大豆異黃酮可能是水豆豉提取物中促進細胞凋亡的關鍵活性成分。

圖7 SDC對CRPC細胞形態的影響（100×）Fig.7 Influence of SDC on CRPC cell morphology（100×）

2.2.4 提取物對CRPC細胞中PSA含量的影響 與對照組相比，各劑量組均能抑制22RV1細胞中PSA的分泌，但水豆豉提取物對Vcap細胞中PSA的分泌沒有抑制作用。PSA作為前列腺癌特異性標志物，其含量與疾病的發展息息相關，可及時反映前列腺癌患者的治療情況。在本研究中，水豆豉取物能夠抑制22RV1細胞PSA的分泌， CRPC細胞擁有雄激素合成所需的酶及調節蛋白，可以通過從頭合成途徑將膽固醇合成雄激素，從而激活 AR信號通路，但該提取物是否是通過作用于AR信號通路進而抑制其分泌還需進一步研究(圖8)。

圖8 SDC對CRPC細胞分泌PSA的影響Fig.8 Effects of SDC on PSA secretion by CRPC cells

2.2.5 提取物對CRPC細胞中DHT及T含量的影響提取物濃度≥4 mg/mL時抑制22RV1細胞DHT的合成，提取物濃度≥8 mg/mL時抑制Vcap細胞DHT的合成。各劑量組的提取物均能抑制22RV1和Vcap細胞T的合成。DHT是前腺癌細胞通過從頭合成途徑合成的最終產物，水豆豉提取物能下調CRPC細胞DHT的表達水平，這提示水豆豉提取物能夠有效的抑制CRPC細胞雄激素的合成，但其抑制機制還需進一步研究(圖9)。

圖9 SDC對CRPC細胞分泌DHT及T的影響Fig.9 Effects of SDC on DHT and T secretion by CRPC cells

3 結論

比較3株高產蛋白酶菌株單菌發酵水豆豉后理化特性、活性成分及抗氧還能力的改變，發現均有不同程度地改變和提升，并篩選出一株具有較好理化特性及抗氧化活性的B19菌株，為進一步研發水豆豉健康相關產品提供理論依據；以B19菌株在前期確定的最佳發酵條件下發酵制備水豆豉，發現其水提物對CRPC細胞具有選擇性殺傷作用，并能促進其凋亡，同時對前列腺特異性抗原（PSA）、雄激素睪酮（T）和二氫睪酮（DHT）分泌有抑制作用，為后續探討水豆豉對前列腺癌作用的相關機制提供思路和數據參考，水豆豉提取物抑制CRPC細胞的潛在機制值得進一步深入研究。