3M PetrifilmTM快速測試片用于飲料中菌落總數的測定

張婉君，張 蘭

（達能(中國)食品飲料有限公司, 廣東中山528415）

菌落總數是食品衛生檢查中的重要指標，代表著食品受污染的程度[1]。在飲料的質量控制中，菌落總數是必檢項目，當前菌落總數的權威檢測方法是GB 4789.2-2016中的平板計數法及T/CBIA 005-2019中的濾膜法[2-6]，由于飲料行業對于微生物的控制非常嚴格，在滿足國標平板法的基礎上，普遍利用濾膜法作為內控方法用于產品的放行控制。以上兩種方法操作復雜，檢測周期長，存在檢測效率低下的問題，嚴重影響了對微生物污染控制的時效性，制約了企業產品放行速度及運轉效率，這是所有食品飲料行業所面臨的共同難題。

隨著消費觀念的改變，人們對飲料的健康要求越來越高。其中維生素飲料可調整各維生素的比例和含量，在一定程度上調節人體功能，是目前消費者所喜愛的飲料品類。而結合健康和安全性的綜合考慮，維生素飲料在富含多種維生素的前提下，一般防腐劑含量較低，需要嚴格的微生物質量控制措施來保證產品的出廠合格性[7]。因此尋求一種準確性和效率相結合的微生物檢驗方法，是對產品質量的有力保障。而近年來隨著現代生物科技水平的不斷提高，許多快速測檢測方法不斷出現，如電阻抗法、流式細胞技術、激光掃描技術、ATP生物熒光、快檢紙片法等[8]，在簡化操作步驟、縮短培養時間和檢測大批量樣本上具有明顯的優勢。其中3M PetrifilmTM快速測試片以其操作簡便、準確度高、結果出具快速等特點受到廣泛關注。3M PetrifilmTM菌落總數快速測試片培養時間僅需24 h，而平板法及濾膜法需要2 d左右。目前3M PetrifilmTM菌落總數快速測試片應用非常廣泛且早已獲得認可，但是僅針對于其與國標平板法的替代，行業內關于濾膜法與3M PetrifilmTM測試片法直接檢測維生素類飲料（pH＜4.6）菌落總數方面的替代研究，還鮮有報道。隨著2015年國家食品安全法的大力提倡，利用快速檢測方法快速放行產品已成為行業趨勢，因此進行3M PetrifilmTM菌落總數測試片與濾膜法的一致性研究對于飲料行業具有非常重大的經濟價值與現實意義，可以縮短培養時間，加快產品放行，提高產品新鮮度和降低庫存成本。

因此，依據《中國藥典》中微生物替代方法驗證菌株選用原則以及此類維生素飲料（pH＜4.6）中可能存在的高污染風險菌株。本實驗選擇了四株標準菌株（大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉）和三株自主分離的野生型菌株（愛媛類芽孢桿菌、Asia Siamensis、白色念珠菌），使用濾膜法和3M PetrifilmTM快速測試片法進行菌落總數的定量測定，通過線性擬合度、準確度、重現性、精密度、專屬性、等效性分析判斷兩種方法的一致性程度，確定3M PetrifilmTM快速測試片法作為飲料中菌落總數檢測方法使用的可行性[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素類飲料（pH＜4.6） 脈動 市場購買；平板計數瓊脂（PCA）培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；3M PetrifilmTM快速菌落總數測試片 美國3M公司；濾膜（白色底、黑色網格、纖維素酯、直徑47 mm、孔徑0.45 μm）密理博（中國）公司；60 mm培養皿 廣東環凱微生物科技有限公司；菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）、黑曲霉（ATCC 16404） 美國Microbiologics公司；愛媛類芽孢桿菌、Asia Siamensis、白色念珠菌 達能集團自主分離鑒定。

ICP 500生化培養箱 美墨爾特（上海）貿易有限公司；MDF-86V188E超低溫冰箱 安徽中科都菱商用電器股份有限公司；BSC-1300ⅡA2生物安全柜/SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DENSIMAT比濁儀 生物梅里埃（中國）公司；EZ-STREAM, EZ-FI三聯過濾裝置 密理博（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 細菌菌懸液的制備[10]：將供試菌（大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、愛媛類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌）分別接種到平板計數瓊脂（PCA）培養基上，于（36±1）℃的培養箱中培養24～48 h。使用接種環取一環活化好的菌種于10 mL 0.85%的生理鹽水中，震蕩混勻，使用細菌比濁儀測定菌懸液菌落數，備用。

真菌菌懸液的制備[10]：將供試菌（白色念珠菌、Asia Siamensis、黑曲霉）分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養基上，于（28±1）℃的培養箱中培養3～5 d。使用接種環取一環活化好的菌種于10 mL 0.85%的生理鹽水中，震蕩混勻，使用血細胞計數法確定菌懸液菌落數，備用。

1.2.2 多梯度水平測試 將1.2.1中制備的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌懸液混合（因大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌均為致病菌，在pH4.6的環境下基本不存在風險，因此將2者歸為一類進行研究）接入維生素類飲料（pH＜4.6）中，為組A（大腸埃希氏菌與金黃色葡萄球菌的比例為1:1），其余5種菌懸液（愛媛類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、Asia Siamensis、白色念珠菌、黑曲霉）則分別接入維生素類飲料（pH＜4.6）中，記為組B、C、D、E、F。六組樣品均制備終菌含量為5、25、50、75及100 CFU/25 mL的待測樣品（結合酸性（pH＜4.6）的飲料微生物污染的風險較低，一般不超過102和3M測試片的指導使用方法建議兩方面的實際情況，按照合適的限量進行低中高水平設置）。使用濾膜法及3M測試片法進行測試。同時使用兩種方法對未接種的飲料樣本進行空白測試。

濾膜法：使用無菌鑷子夾住濾膜的邊緣，網格面朝上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾杯。向濾杯中倒入25 mL待測樣品，打開抽濾泵開關，打開過濾閥門進行抽濾。水樣抽濾完全后，關閉抽濾泵及抽濾閥門，取下濾杯，使用無菌鑷子夾住濾膜邊緣，網格朝上貼片于平板計數瓊脂（PCA）培養基上，（36±1）℃培養48 h[11]。

3M測試片法：以濾膜法抽濾25 mL樣品，隨后將測試片放置于平坦表面，揭開上層膜，用無菌鑷子夾住濾膜邊緣，網格朝上貼片于測試片培養面積內，添加1 mL無菌水，使上層膜直接落下，利用壓板輕輕下壓，隨后于（36±1）℃培養24 h[12]。

以上測試結果均需進行回收率計算，計算公式如下：

式中：A0表示3M測試片法計數結果平均值（CFU/25 mL）；A1表示濾膜法計數結果平均值（CFU/25 mL）。

1.2.3 混合菌液測試 將1.2.1中的菌懸液按照細菌、真菌類別混合。細菌組為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、愛媛類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌按照1:1:1:1混合，真菌組為Asia Siamensis、白色念珠菌、黑曲霉按照1:1:1混合，這兩組分別接入維生素類飲料（pH＜4.6）中，因20～80 CFU/25 mL為3M測試片法最具代表性且最能清晰計數的區間（3M測試片生產商針對3M測試片使用給出的使用建議），則將以上兩組均制備為最終菌含量為20～80 CFU/25 mL的待測樣品。使用濾膜法和3M測試片法進行測試，并按照式（1）進行回收率計算。同時使用兩種方法對未接種的飲料樣本進行空白測試。

1.2.4 重現性測試 將1.2.1中制備的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌懸液混合接入維生素類飲料（pH＜4.6）中，其余5種菌懸液（愛媛類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、Asia Siamensis、白色念珠菌、黑曲霉）則分別接入維生素類飲料（pH＜4.6）中。六組樣品均制備菌含量為5、50、150 CFU/25 mL的待測樣品。使用濾膜法及兩個不同批次的3M測試片法進行測試[13]。同時使用兩種方法對未接種的飲料樣本進行空白測試。

1.3 數據處理

所有實驗均進行5次平行測定。使用MedCalc軟件及Excel 2010進行實驗數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 線性分析

實驗結果顯示3M測試片法和濾膜法測試的空白組均無菌檢出，表明接種前飲料中無其他微生物的干擾。將接種組中檢測獲得的菌含量換算為log形式，以3M測試片法結果為Y軸，濾膜法結果為X軸繪制曲線，計算決定系數R2，R2不得低于0.95[14]。使用濾膜法和3M測試片法對進行人工污染的維生素類飲料（pH＜4.6）中的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌、愛媛類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、Asia Siamensis、白色念珠菌、黑曲霉菌菌落計數后的線性擬合結果見圖1和表1，決定系數R2分別為0.9934、0.9932、0.9822、0.9892、0.9858、0.9878，均大于0.95，表明兩種方法線性擬合關系良好[15]。在線性擬合情況良好的情況下，可計算得出6組測試組的線性范圍，分別為0.85～2.04、0.64～1.95、0.58～1.98、0.64～1.93、0.73～2.00及0.53～1.90（log CFU/25 mL）。

圖1 3M測試片法與濾膜法檢測6組菌的擬合曲線Fig.1 Fitting curve of the 6 groups of bacteria determined by the filter membrane method and the 3M test tablet method

表1 3M測試片法與濾膜法檢測6組菌的擬合結果Table 1 Fitting results of the 6 groups of bacteria determined by the filter membrane method and the 3M test plate method

2.2 準確度及專屬性分析

準確度指的是被測量物的測量值與指定值之間的一致性程度。微生物的定量檢測方法的準確度則需在一定的檢測范圍內使用待確認方法與已被認可方法共同測試，使用回收率來評估待確認方法與已被認可方法的一致性程度，其中回收率要求≥70%[14,16]。本實驗則是根據1.2.2中的測試結果，將3M測試片法相對于濾膜法的回收率（%）進行計算，以評估兩種方法的一致性程度。由表2可知，人工污染的六組維生素類飲料（pH＜4.6）在五個不同菌濃度梯度下的3M測試片法回收率范圍在76.0%～122.2%之間，均＞70%，表明3M測試片法的準確度較高，該方法與濾膜法具有較好的一致性。

表2 6組菌株在不同測試水平下的菌落總數的回收率Table 2 Recoveries of total colonies of the 6 groups of strains at different test levels

微生物定量檢測方法的專屬性是通過檢測與方法相適應的菌株，分析該方法可定量檢出目標微生物的能力。檢測能力評估方式則是與已被認可和廣泛接受的相關方法相比較，要求待確認方法檢出結果不得少于已被認可的相關方法的70%[17-18]。本實驗則是根據1.2.3中的測試結果，將3M測試片法相對于濾膜法的回收率（%）進行計算，以評估該方法的專屬性?？瞻捉M均無菌檢出，表明接種前飲料不存在其他微生物的干擾。由表3可知，細菌混合組和真菌混合組的3M測試片法回收率分別為99.4%和95.6%，均大于70%，表明3M測試片法對于細菌及真菌的定量檢驗專屬性較好。

表3 兩類混合菌株的菌落總數回收率Table 3 Recoveries of total colonies of the two mixed strains

2.3 精密度和重現性分析

微生物方法定量的精密度評估是通過檢驗一定數量的目標菌，計算多次重復下結果的一致性程度[19-21]。將1.2.2中的實驗方法結果計算分析得到相應的RSD值，可知濾膜法和3M測試片法分別測試人工污染的維生素類飲料（pH＜4.6）中菌落總數的精密度（表4）。根據2020《中國藥典》中的規定，不同菌濃度下預期的RSD見表5。3M測試片法五個濃度測試水平（5、25、50、75、100 CFU/25 mL）下的RSD值范圍分別為21.1%～34.3%、12.4%～17.2%、7.2%～14.2%、4.2%～10.5%、2.9%～7.1%，濾膜法五個濃度測試水平（5、25、50、75、100 CFU/25 mL）下的RSD值范圍分別為17.8%～33.0%、9.5%～21.5%、8.0%～13.9%、5.5%～7.8%、3.0%～7.6%?？梢?M測試片法的測試RSD值均滿足要求，且其與濾膜法的RSD值相近，表明3M測試片法的精密度較好。

表4 濾膜法與3M測試片法的精密度比較分析Table 4 Comparison analysis of precision between filter membrane method and 3M test tablet method

微生物定量方法的重現性分析是在實驗基質不變的情況下，當實驗條件發生變化時，實驗結果的精密度分析[22-23]。本實驗使用人工污染的維生素類飲料（pH＜4.6）樣品進行測試，判斷兩個批次生產的3M測試片法測試結果的一致性程度?？瞻捉M均無菌檢出，表明接種前飲料不存在其他微生物的干擾。實驗組數據分測試水平及批次計算RSD值見表6，批次1在三個測試水平下（5、50、150 CFU/25 mL）的RSD值分別為21.1%～34.3%、7.2%～14.2%、3.6%～8.2%，批次2在三個測試水平下（5、50、150 CFU/25 mL）的RSD值分別為17.3%～34.3%、9.0%～14.4%、3.9%～7.9%。結果顯示RSD值均滿足表5要求，表明3M測試片法的重現性良好。

表5 不同含菌濃度下預期的相對標準偏差[14]Table 5 Expected relative standard deviations at different concentrations of bacteria[14]

表6 3M測試片法兩個批次測試片的重現性比較分析Table 6 Comparative analysis of reproducibility of two batches of 3M test tablets

2.4 相對正確度（Relatively trueness）分析

相對正確度研究是利用Bland-Altman分析法對已被認可方法的結果與待確認方法的結果之間的比較研究[24-25]?？墒褂肕edCalc軟件對1.2.2中獲得的數據進行分析，對濾膜法和3M測試片法測試人工污染的維生素類飲料（pH＜4.6）中的菌落總數的一致性進行評價。均數線（Mean）越靠近Y=0的虛線，表明兩種方法的系統誤差越小[26]，且當圖中大部分的點落在一致性區間內時，可認為兩種方法的一致性較好，可以將兩種方法替換使用[27-28]。

濾膜法和3M法測試人工污染的維生素類飲料（pH＜4.6）中的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌、愛媛類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、Asia Siamensis、白色念珠菌、黑曲霉的B-A分析如圖2所示。六組菌株測試組的配對數據的均數值分別為-0.006、-0.015、0.016、-0.040、-0.012、-0.004，與Y=0的虛線接近，且六組菌株測試組分別僅有0%、4%、8%、0%、4%和0%的點落在了一致性區間以外。表明兩種方法測量結果的的系統誤差小，一致性程度高。

圖2 濾膜法和3M測試片法測定6組菌的B-A分析圖Fig.2 B-A analysis of the 6 groups of bacteria determined by the filter membrane method and the 3M test tablet method

2.5 精度剖面（Accuracy profile）分析

精度剖面分析是使用兩種方法對至少三個污染濃度梯度的樣品進行的重復性定量檢驗[24]。對于所有污染水平，需將β-期望容忍區間（β-Expected tolerance interval,β-ETI）與可接受限（Acceptable limit, AL）相比較，即β-ETI的上限值≤AL和下限值≥-AL時，該方法被認為與基準方法相當[29-30]。

將1.2.4中的測試結果轉換為對數值后，以濾膜法中位值為橫坐標，偏差（Bias，Bi）為縱坐標，繪制包括Bi、上下限β-ETI分析線的分析圖譜。而準確度的可接受性限制為AL=±0.5log10單位。結合表7及圖3可知，六組菌株人工污染組的3個水平的上下限β-ETI均在可接受限制范圍以內，表明濾膜法和3M測試片法測定人工污染的維生素類飲料（pH＜4.6）中菌落總數的方法等效。

圖3 濾膜法和3M測試片法測定6組菌的AP分析圖Fig.3 AP analysis of the 6 groups of bacteria determined by the filter membrane method and the 3M test tablet method

表7 AP分析結果Table 7 AP analysis results

3 結論

本研究采用3M PetrifilmTM菌落總數測試片法替代濾膜法定量檢測維生素類飲料（pH＜4.6）的菌落總數，通過添加不同類型的7種菌株進行驗證。將7種菌株進行分組后人工添加不同濃度梯度的菌懸液至維生素類飲料（pH＜4.6）中，分別運用3M PetrifilmTM菌落總數測試片法及濾膜法對比檢測。結果顯示，兩種方法的線性擬合R2均大于0.95，且在梯度水平測試、菌株分類接種污染及批次符合度的測試中，3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測數據的回收率及RSD結果均滿足《中國藥典》中對于微生物方法確認的要求。相對正確度和精度剖面分析中，兩種方法也顯現出較好的一致性和等效性。表明3M PetrifilmTM菌落總數測試片法可等同替代濾膜法進行維生素飲料（pH＜4.6）中菌落總數的檢測。除此之外，張芬[4]將3M菌落總數測試片法、國家標準法（4789.2-2016）及ISO（4833-1:2013）在檢測面粉、花生和香辛料上進行了對比研究，通過線性分析和相關性分析，得出三種方法具有良好的一致性。許金榜[31]使用VRBA平板和3M大腸菌群測試片對8株菌進行了定性定量分析，在生長率測試、選擇性、質控樣品和能力驗證樣品測試中，3M測試片法都表現出與VRBA平板測試法的高度一致性，顯示兩種方法可以無差異使用。由此可知對于工業生產來說，3M測試片法具有很高的檢測可靠度，并且該方法可以略去檢測前處理的繁雜操作，并能縮短檢測周期，在一定程度上可降低產品的庫存壓力，保障產品流通至市場的新鮮度。進一步可對3M測試片進行其他品類及其他目標菌株檢測的相關驗證工作，對傳統的檢測方法做出可靠的替代方法補充，這一類領域的開發將在食品企業中具有很好的應用前景。