牛乳極性脂質的提取工藝優化及成分鑒定

劉明真，王彤文，張 濤，姜瀟瀟，劉文正，陶明煊，楊 瑤，劉 琛，郭宇星

（南京師范大學食品與制藥工程學院, 江蘇南京 210000）

極性脂質是所有生物膜中的天然成分，被廣泛應用于改善食品的結構和乳化特性，其工業來源主要為大豆和蛋類[1]。研究表明，動物來源的極性脂質中含有豐富的神經鞘磷脂，對細胞代謝和調節有著積極的作用，因此，受到越來越多的關注[2]。然而，由于法律和現實條件的限制，動物源大腦和骨髓的使用相對局限[3]，這也進而影響了動物源極性脂質的開發利用。

乳中的極性脂質主要存在于乳脂肪球膜（Milk fat globule membrane，MFGM）上[4-5]。牛乳中含有豐富的MFGM，它是乳中包裹在脂肪球體外部的一層膜[6-7]，由極性脂質、膜蛋白、膽固醇等成分構成，其中，乳極性脂質含量約占總乳脂肪含量的1%[8-9]。乳極性脂質主要包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和神經鞘磷脂（SM）[10]。研究表明，乳極性脂質可以保護肝臟[11]，具有促進新生兒腸道成熟和神經生長[12]、改善腸道菌群[13]，抗大腸癌等[14]作用。同時由于乳極性脂質特殊的兩性分子結構，使其具有一定的功能性應用價值[15-16]。目前，乳極性脂質被廣泛應用于化工、食品、醫藥等領域，如嬰幼兒配方奶粉、脂質體等的制備[17]。酪乳和黃油乳清作為乳制品行業的副產物，含有較高的MFGM和較低的甘油三酯[18]，同時具有比牛奶更長的貯藏期，因此，更易作為牛乳極性脂質提取的原料[19]。

目前報導的乳極性脂質的提取方式大致可以分為物理提取法和化學提取法[20-21]。物理提取法是利用超臨界萃取技術或膜技術進行分離提取，操作簡單但價格較昂貴[22]。GASSI等[23]從奶油乳清中經過脫脂、熱處理、酸沉淀酪蛋白、再通過透析和超濾法獲得極性脂質。化學提取法是通過氯仿、甲醇、乙醚、乙醇等有機溶劑進行提取，氯仿-甲醇作為一種常用的有機溶劑，可以把樣品中所有的脂溶性物質完全提取出來，且對中性脂質和極性脂質的提取效率均較高，但步驟較繁瑣，耗時較長[22,24]。乳中提取牛乳極性脂質還未建立完善的提取工藝，酪乳粉是乳極性脂質很好的來源。本研究擬建立并優化氯仿-甲醇浸提法從酪乳粉中提取乳極性脂質，采用響應面法對比不同條件下提取樣品中磷脂的含量，篩選出最優的提取參數，并通過薄層層析法對提取樣品中的極性脂質進行分析與鑒定。該研究旨在于探索適用于酪乳加工業的簡單脂質提取方法，一方面可為乳極性脂質的開發提供研究基礎，另一方面也可為提升酪乳粉的開發利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪乳 美國Bob’s Red Mill公司，配料表如表1所示；大豆卵磷脂（純度＞95%） 上海生物工程有限公司；磷脂酰絲氨酸（PS） 標準品，美國Sigma公司；磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、神經鞘磷脂（SM） 標準品，中國食品藥品檢定研究院；丙酮、氯仿、甲醇、膽固醇、三氯化鐵、硫氰酸銨 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

表1 酪乳粉成分Table 1 Ingredient list of buttermilk powder

GL-21M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；V5100型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；RE52CS-1旋轉蒸發儀 上海亞榮有限公司；ZNCL-GS型智能磁力攪拌器 上海越眾儀器設備有限公司；IS128C型實驗室pH計 上海儀邁儀器科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳極性脂質的提取 參考王然然等[25]的方法并做修改。稱取1.5 g酪乳粉配制成質量濃度為10%（m/v）的溶液，置于40 ℃水浴鍋中攪拌至全部溶解。使用滴管緩慢滴加3 mol/L乳酸溶液調整pH至4.6，用高速離心機以8000 r/min離心30 min，收集上清液于燒杯中，備用。向燒杯中加入6 mL一定體積比的氯仿-甲醇混合液，然后用磁力攪拌器在不同溫度下攪拌一定時間，將混合溶液以8000 r/min離心20 min，收集下層有機相，上層水相繼續加入氯仿-甲醇混合液重復上述步驟兩次。將收集的下層有機相過濾后用蒸發濃縮至粘稠狀，隨后轉移至小燒杯中，氮氣吹干。最后在小燒杯中加入丙酮，攪拌后，過濾收集沉淀，氮氣吹干，置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 乳極性脂質提取條件單因素實驗及響應面優化

1.2.2.1 單因素實驗 稱取1.5 g酪乳粉，控制轉子轉速為300 r/min，以磷脂含量為指標，分別對氯仿-甲醇體積比、料液比、提取溫度、提取時間4個因素進行單因素實驗，確定各因素對提取樣品磷脂含量的影響。實驗基本條件為：氯仿-甲醇體積比為2:1，料液比為1:4，提取溫度為25 ℃，提取時間為5 min。分別考察氯仿-甲醇體積比（v/v, %）（3:1、5:2、2:1、1:1、2:3）；酪乳粉酸沉后的上清液和有機試劑總體積之比即料液比（v/v, %）（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）；提取溫度（10、20、30、40、50 ℃）；提取時間（1、3、5、10、15 min）各因素對提取樣品磷脂含量的影響。

1.2.2.2 響應面試驗 根據Box-Behnken設計原理，分別選取氯仿-甲醇比（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4個單因素最佳值及其前后相鄰值作為試驗因素，并選取磷脂含量為響應值，進行響應面優化設計，得到磷脂提取最優條件。試驗設計因素與水平見表2，采用Design-Expert 11軟件進行數據分析。

表2 響應面因素水平編碼Table 2 Factors and levels of response surface text

1.2.3 乳極性脂質含量的測定 乳極性脂質的主要成分為甘油磷脂類，所以采用磷脂測定法測定乳極性脂質的含量。參考龔金炎等[26]的方法并做修改。使用氯仿配制0.2 mg/mL的大豆磷脂標準溶液，分別取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL大豆磷脂標準溶液于具塞離心管中，加氯仿至4 mL，加硫氰亞鐵銨顯色劑4 mL，振蕩混勻1 min，300 r/min離心10 min，取下層。以氯仿為空白，在485 nm處測定吸光值A，以A對濃度C（mg/mL）進行線性回歸，繪制大豆磷脂標準曲線，得到回歸方程y=5.0883x-0.0011（R2=0.9989）。

隨后用氯仿配制1 mg/mL極性脂質樣品，按上述方法測定，將測定OD值帶入標準曲線計算磷脂濃度C，根據以下公式計算磷脂含量：

式中：V測為測樣體積； M測為測樣質量； M提取為提取樣品質量； M總為酪乳粉總質量。

1.2.4 乳極性脂質的鑒定 使用薄層層析法對乳極性脂質進行鑒定[27]。以氯仿為溶劑，將提取的乳極性脂質樣品和PC、PE、PI、PS、SM標準品配制成1 mg/mL的溶液。分別用毛細管吸取半管極性脂質樣品和標準品點樣在硅膠板下端1 cm左右，點樣2～3次，迅速吹干。將點完樣的硅膠板立式放入裝有展開劑（氯仿-甲醇-水-氨水比例為3:2:0.3:0.1，v/v/v/v）的層析缸中。至展開劑到達硅膠板上端1 cm處拿出硅膠板，吹干后置于碘缸中顯色，根據以下公式計算遷移率Rf：

式中：a為展開后斑點中心到原點之間的距離，mm；b為原點到溶劑前沿的距離，mm。

1.3 數據處理

所有的實驗重復3次，實驗數據采用SPSS軟件進行統計學分析，單因素方差分析檢驗組件的顯著性差異，數據用±s表示，組間差異采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 極性脂質提取條件優化

2.1.1 氯仿-甲醇比對極性脂質提取的影響 由圖1可看出，在3:1～2:1范圍內，磷脂含量隨氯仿-甲醇體積比的減小而增加，在2:1～2:3范圍內，磷脂含量隨著氯仿-甲醇體積比的減小而減小。當氯仿-甲醇體積比為2:1時，磷脂的含量達到最大值，此時磷脂含量為（1.372±0.035）mg/g。

圖1 有機試劑氯仿與甲醇的體積比對磷脂含量的影響Fig.1 Effect of the volume ratio of chloroform and methanol on extraction quantity of phospholipid contents

2.1.2 料液比對極性脂質提取的影響 圖2為原料酪乳粉與有機溶劑的質量比即料液比對磷脂含量的影響，隨著有機溶劑用量的增多，所得磷脂含量也增加，說明有機溶劑用量越多溶解的磷脂越多，提取率越高；但當料液比達到1:4之后，磷脂含量又有所下降。隨著料液比增加，不僅總體積增大；而且當料液比達到一定值時，磷脂的溶解達到了飽和狀態，增加有機溶劑用量使物料中的非磷脂成分融入溶劑中，影響提取的磷脂含量。陳康等[28]提取南極磷蝦磷脂時也發現增加有溶劑用量到一定值后磷脂提取量不會增加。所以從節約材料的角度考慮，最優料液比為1:4。

圖2 物料與有機溶劑的料液比對磷脂含量的影響Fig.2 Effect of the weight ratio of material and organic solvent on extraction quantity of phospholipid contents

2.1.3 溫度對極性脂質提取的影響 由圖3可知，提取溫度對磷脂含量有很大的影響，在10～50 ℃的范圍內，磷脂含量隨著溫度的升高先增加后降低，在20 ℃時，磷脂的含量達到最高（1.440±0.008）mg/g，與其他組的差異顯著（P＜0.05），在20～50 ℃范圍內，磷脂含量開始減少。酪乳中含有豐富的酪蛋白，并且磷脂主要存在于MFGM上，過高的溫度會導致蛋白質熱變性，影響磷脂溶出，同時磷脂在高溫下易發生氧化作用而被破壞，且溫度升高加快了有機試劑的揮發[29]。因此，最佳提取溫度選擇20 ℃。

圖3 提取溫度對磷脂含量的影響Fig.3 Effect of the extraction temperature on the extraction quantity of phospholipid contents

2.1.4 提取時間對極性脂質提取的影響 由圖4所示，在1～10 min范圍內，磷脂含量隨著時間的增加而升高，此后，磷脂含量隨提取時間的變化不存在顯著性差異(P＞0.05)。在固液萃取過程中，磷脂向有機相中擴散需要一定的時間，所以隨著時間的增加，樣品中磷脂含量會增加，提取率也會隨之升高。實驗結果表明，當提取時間達到10 min時，磷脂基本已全部擴散至有機相中，此時提取樣品中磷脂含量達到最大值（1.474±0.065）mg/g。因此本研究選擇提取時間10 min為最佳提取時間。

圖4 提取提取時間對磷脂含量的影響Fig.4 Effect of the extraction time on the extraction quantity of phospholipid contents

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗設計因素與水平 為了得到牛乳極性脂質提取工藝的最適參數，根據上述單因素實驗得到的較優提取參數，采用響應面法對氯仿-甲醇比、料液比、提取溫度、提取時間四個因素影響進行響應面試驗設計。通過單因素實驗確定從酪乳粉中提取極性脂質的四個單因素參數適宜范圍，選取樣品中磷脂含量為考察指標進行響應面優化。結果見表3。

2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析 利用軟件Design-Expert 11軟件對表3試驗數據進行非線性多元回歸擬合，得到回歸模型為：

表3 Box-Behnken實驗設計及結果Table 3 Design and result of Box-Behnken experient

由表4可知，本實驗選用的二次多項式模型差異極顯著（P＜0.01），失擬項差異不顯著（P＞0.05），說明方程可靠，此模型的擬合度好，可通過此響應面模型來確定最佳提取工藝條件。A、B、C、D及A2、B2、C2、D2對Y具有顯著影響（P＜0.05）。同時顯著性檢驗顯示回歸模型的R2為0.9900，調整后的R2為0.9800，殘差的平方和為0.0821，純誤差的平方和僅為0.0065，進一步說明該模型的擬合效果好。

表4 回歸方程模型的方差分析及系數的顯著性檢驗Table 4 ANOVA for regression equation model and significance test of the coefficient

圖5 為任意兩個因素的交互作用對磷脂含量的影響，結合表4結果，交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD對試驗結果的顯著性分析均為P＞0.05，表明氯仿-甲醇比、料液比、提取溫度和提取時間這4個因素的兩兩交互作用不顯著。上述回歸模型的最佳值存在響應面最高點，等高線圖的圓心，即提取磷脂含量最大時的穩定點，與之對應的因素水平即為最佳工藝條件。

圖5 交互作用對磷脂含量的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of interaction on phospholipid contents

運用Design Expert 11軟件分析得最優乳極性脂質提取工藝條件為：酪乳粉1.5 g，氯仿體積4 mL，甲醇體積2 mL，料液比為1:4，磁力攪拌器提取溫度20 ℃，轉速300 r/min，提取時間10 min。在此條件下進行，進行3次磷脂提取實驗，測得實際提取磷脂含量為（1.647±0.010）mg/g。同時，實際提取量與模型所預測的1.707 mg/g理論值誤差在3.64%之內，說明所得結果可靠。

2.3 薄層層析定性分析

通過薄層層析，鑒定出的乳極性脂質主要有5種，為磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和神經鞘磷脂（SM）。從圖6中可以看出，樣品中各組分展開效果好，無拖尾現象，區分度好。其中PC、SM、PE、PI、PS五種標準物質僅有一個斑點，樣品中有四個斑點，標注為A、B、C、D。五種標準物質和樣品的各色斑的Rf值測算結果如表5所示：樣品中A、B、C、D點的Rf值分別為0.74、0.45、0.30、0.15，標準品PE的Rf值 為0.73，PC的Rf值 為0.44，PI和SM的Rf值均為0.29，未區分開，PS的Rf值為0.14。因此可初步定性推斷出A點物質為PE，B點物質為PC，C點物質為PI或SM，D點物質為PS。由此可得，從酪乳粉中提取的極性脂質，至少含有磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）等。

圖6 樣品與標準品的薄層層析圖Fig.6 Thin-layer chromatogram of samples and standard phospholipid

表5 薄層層析各色斑的Rf值測算結果Table 5 The Rf values of each components

3 結論

本實驗建立了從酪乳粉中提取乳極性脂質的方法，通過單因素試驗和響應面分析對提取工藝進行優化，得到了從酪乳粉中提取乳極性脂質的最優條件：氯仿-甲醇比為2:1，料液比1:4，提取溫度和時間分別為20 ℃和10 min，磁力攪拌器最佳提取溫度為20 ℃，轉速為300 r/min，在此條件下進行乳極性脂質提取實驗，提取樣品的磷脂含量可達到（1.647±0.010）mg/g。該提取工藝磷脂提取率較高，提取速度快，工藝流程簡單，易于規模化生產。此外，通過薄層層析法分析，可以確定提取樣品中有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、神經鞘磷脂等極性脂質的存在。該提取工藝安全性高，適用于食品工業生產，很好地增加了酪乳粉的附加利用值，并為乳極性脂質的提取提供了研究基礎。