綠色高效連續分離技術制備蛋黃中活性蛋白質和磷脂

柳 聰，周 欣，羅進旭，夏民權，李小萌，王 晨，蔡朝霞,,

（1.華中農業大學食品科學技術學院, 教育部環境食品學重點實驗室, 蛋品加工技術國家地方聯合工程研究中心, 湖北武漢 430070；2.高郵市秦郵蛋品有限公司, 江蘇揚州 225000）

我國是禽蛋生產和消費大國，禽蛋產量占世界總產量的40%以上，已連續多年居世界第一。禽蛋是人類優質蛋白質和脂質攝取的重要來源，具有營養豐富、配比均衡、價廉易得等優點，尤其是蛋黃中富含卵黃免疫球蛋白（immunoglobulin Y, IgY）、卵黃高磷蛋白（phosvitin, PV）、磷脂（phospholipids, PL）等功能活性組分。IgY的結構和功能均與哺乳動物免疫球蛋白（immunoglobulin G, IgG）相似，可通過特異性抗原免疫雞以產生特異性IgY來對抗多種疾病[1]，且在藥物、功能性食品和食品保藏等領域均有重要應用[2-3]。PV是蛋黃中主要的磷酸化蛋白，含有30%～50%的磷酸化絲氨酸，具有良好的表面活性[4-5]、抗氧化活性、抗癌活性和抗菌活性，PV因其高附加值而被廣泛用于化妝品、營養品、食品和制藥工業[6]。PL約占蛋黃油脂總量的33%，主要由80.5%磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline, PC）和11.7%磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PE）組成，被廣泛用作營養補充劑，以及食品、藥物和化妝品行業中的高效乳化劑和潤滑劑[7-9]。

蛋黃是禽蛋中營養豐富的組分，具有高蛋白和高脂質的特點，蛋白和脂質分布在漿質和顆粒中。漿質中含有85%的低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）和15%的IgY[4]。顆粒中有70%的高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）和16%的PV，它們通過磷鈣橋連接。從鮮蛋黃中分離和純化IgY的主要障礙是存在不溶于水的成分，如脂蛋白[10]。蛋黃中磷脂含量較高，占蛋黃質量的16%，在IgY分離過程中可自發形成雙層納米囊泡[11-12]，是IgY純化步驟的主要障礙之一，為了解決這一問題，可采用水稀釋法進行分離[13-14]。目前最常用的方法有卡拉膠[10,15]、辛酸[16]、酸性蒸餾水稀釋[17]，卡拉膠的去脂效果較好，但對蛋黃顆粒部分的物質提取有影響，不利于蛋黃的綜合利用。REN等[18]比較了各種方法對IgY的提取效果，認為酸性條件下的水稀釋法是一種綠色環保、極具成本效益的方法。親和色譜法和離子交換色譜法可獲得高純度、低得率的IgY[19-21]。另外，單一沉淀劑如聚乙二醇[22]和硫酸銨[10,19]已用于進一步純化IgY。盡管在這些條件下得率很高，IgY的純度約為80%。經過進一步的研究，硫酸銨和氯化鈉共同使用可以使IgY的純度提高到90%[23]。PV主要以高密度脂蛋白-卵黃高磷蛋白復合物的形式存在于不溶性組分中。己烷、氯仿、乙醚等[24-25]可提取蛋黃中殘留的脂質，但有機溶劑殘留等問題難以解決，進而限制其應用范圍[26]。為了進一步純化PV，采用NaCl從蛋白混合物中釋放PV，后調節pH并加熱[27-29]。傳統的PL提取方法有很多缺點，超臨界二氧化碳萃取法和亞臨界丙烷萃取法已廣泛應用于去除中性脂質以獲得PL，這些方法不僅昂貴、難以大規模生產且產品純度很低[30-32]。目前的研究多集中在丙酮、石油醚、氯仿等多溶劑萃取體系上，但殘留的有毒化學試劑對人體有潛在危害[33]。最近，WANG等[9]發現用乙醇制得的PL純度和得率均較高。對蛋黃的單一蛋白或脂質組分進行分離純化普遍存在副產物多、原料利用率低等問題，造成了極大的浪費，而采用綠色高效的方法對蛋黃中多種活性物質進行聯合提取可有效避免此類問題并提高蛋制品的附加值。

本文主要研究蛋黃中活性蛋白質和磷脂的提取工藝，擬開發一種使用綠色溶劑聯合提取IgY、PV和PL的方法，同時避免使用非食品級溶劑，能夠工業化生產，實現蛋黃功能性成分的充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 湖北省武漢市洪山區九峰新躍養雞場提供；PEG 6000 分析純，上海默克化學有限公司；正己烷 色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍R250、考馬斯亮藍G250 武漢市谷歌生物有限公司；標準IgY、PV、PC、PE 美國Sigma公司；Toyopearl DEAE-650M填料 日本TOSOH公司；所有分離用試劑 均為國產分析純。

3-30K離心機 德國Sigma公司；Alpha1-4LD冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；Waters 2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；TSK-GEL G2000SWXLcolume凝膠色譜柱 日本TOSOH公司；Gel DOC 2000凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司；Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent 5977A質量選擇檢測器、DB-23毛細管柱 加拿大Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋黃生物活性化合物提取、純化工藝

1.2.1.1 工藝流程 先將蛋黃用4 ℃去離子水稀釋，離心后得到水溶性組分（water soluble fraction,WSF）和脂蛋白。首先通過鹽析從WSF提取IgY，并用PEG 6000進一步純化。其次，用乙醇從脂蛋白中提取蛋黃油；剩余的沉淀物為PV和一些脂質。用乙醇和乙酸乙酯作為復合溶劑，分離PV和脂類。最后，將所有蛋黃油收集在一起。再加入乙酸乙酯進一步提取PL。提取純化工藝流程如圖1所示。

圖1 純化工藝流程Fig.1 Scheme of the purification process

1.2.1.2 IgY的提取與純化 分別將蛋黃用6、7、8、9、10、11倍體積的4 ℃去離子水稀釋，并用1 mol/L HCl將pH調至5.5，在4 ℃條件下保存過夜，經10000 r/min，4 ℃離心15 min后得到WSF（上清液）和脂蛋白（沉淀）。采用Bradford法測定WSF中蛋白質含量。先向WSF中加入固定濃度（1.0%）的NaCl和不同飽和度（30%、35%、40%、45%、50%）的（NH4）2SO4，優化出最佳飽和度的（NH4）2SO4，后通過最適飽和度（35%）的（NH4）2SO4和不同濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）的NaCl得到最佳的IgY分離條件。在4 ℃下8000 r/min離心15 min后收集沉淀物，用10倍體積的去離子水溶解。通過不同濃度（8%、10%、12%、14%）的PEG 6000再次使懸浮液沉淀，以提高純度。在4 ℃、8000 r/min離心15 min后，收集沉淀物并用去離子水溶解，放入8～14 kDa透析袋中透析脫鹽，后進行冷凍干燥。

1.2.1.3 PV的提取與純化 將1.2.1.2中的脂蛋白與乙醇以0.8（w/v）的比例均質5 min，并在4 ℃下10000 r/min離心10 min。分別收集沉淀物A和上清液A。將沉淀物A與助溶劑（乙醇:乙酸乙酯=2:1，v/v）以1:9（w/v）的比例混合，然后在30 ℃條件下磁力攪拌90 min。通過Whatman濾紙過濾混合溶液，得到沉淀物B，所得濾液為殘留的蛋黃油。將沉淀物B以1:10（w/v）的比例懸浮在10%NaCl中，將懸浮液分成等分試樣。分別將試樣調節pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在90 ℃下磁力攪拌30 min，優化出最佳pH；后將試樣在最適pH 5.0和不同溫度（70、75、80、85、90、95 ℃）條件下磁力攪拌30 min，得到最佳的PV分離條件。10000 r/min離心10 min，收集上清液，通過透析脫鹽，冷凍干燥后分離出PV。

1.2.1.4 蛋黃油的提取 用乙醇和乙酸乙酯以不同比例（乙醇/乙酸乙酯，v/v=1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4）處理沉淀A，確定復合溶劑（乙醇和乙酸乙酯）的比例后，沉淀A與復合溶劑的添加量在1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11（w/v）范圍內優化。將混合物在20 °C下磁力攪拌90 min。過濾懸浮液，在45 ℃下旋轉蒸發濾液，除去乙醇和乙酸乙酯后得到蛋黃油1。同時，將乙醇提取的餾分上清液A在-20 ℃結晶3 h，然后在4 ℃于4000 r/min離心2 min后分離出上清液B和沉淀C。提取的乙醇餾分（上清液B）包含蛋黃油的主要部分，通過旋轉蒸發（40 ℃）除去乙醇，收集蛋黃油2。將剩余蛋白和部分蛋黃油組成的沉淀C轉移到30 ℃中水浴10 min，在4 ℃下4000 r/min離心2 min得到蛋黃油3。將多個提取過程得到的油脂收集在一起即為蛋黃總脂，對冷凍干燥的脂質進行進一步分析。

1.2.1.5 PL的提取 將1.2.1.4中獲得的總蛋黃油溶解于不同體積（w/v=1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7）的乙酸乙酯中，并在不同溫度（0、4、-20 ℃）結晶2 h。在4 ℃下4000 r/min離心2 min后收集沉淀物，冷凍干燥。

1.2.2 SDS-PAGE分析 采用周欣[34]的實驗方法，通過SDS-PAGE分析所得IgY和PV樣品。具體條件為：12%分離膠，4%濃縮膠，pH為8.6的Trisglycine電極緩沖液。當樣品在80 V電壓下遷移到濃縮膠和分離膠界面時，調節電壓至120 V，直至樣品移動至底部。電泳完成后，取出膠，使其在固定液（冰醋酸/乙醇/水，v/v/v=1/5/4）中固定30 min，隨后用考馬斯亮藍R-250染色30 min，最后使用脫色液（冰醋酸/乙醇/水，v/v/v=8/25/67）脫色，每小時換一次脫色液，脫色4～5次至凝膠背景顏色褪成無色。

1.2.3 純度測定 采用美國Waters 2695高效液相色譜儀，用SEC-HPLC法測定PV和IgY的純度。樣品用流動相溶解，使濃度達到1 mg/mL。用TSKGEL G2000SWXL柱在含有0.2 mol/L NaCl（pH7.0）的0.1 mol/L PBS中于214 nm處檢測分析PV的純度。通過TSK-GEL G3000SWXL柱在含0.05%NaN3、0.1 mol/L Na2SO4（pH6.6）的0.1 mol/L PBS中 以0.9 mL/min的速度于280 nm處檢測分析IgY的純度。高效液相色譜中IgY和PV峰面積占總峰面積的百分比即為IgY和PV的純度。PL純度測定參見GB/T 5537-2008中鉬藍比色法。

1.2.4 得率和產率的測定 IgY和PV的得率為最終樣品冷凍干燥后總質量與原料蛋黃體積之比。蛋黃油產率為最終得到蛋黃油質量與咸蛋黃中理論蛋黃油質量之比。具體計算公式如下：

得率（mg/mL蛋黃）=最終樣品冷凍干燥后總質量/原料蛋黃體積

式中：0.34為蛋黃中蛋黃油的理論量[35]。

1.2.5 脂肪酸成分分析 精確稱取20 mg油樣于10 mL具塞試管，加入4 mL NaOH-MeOH（0.1 mol/L）溶液，通入氮氣后密封，渦流振蕩15 s后于65 ℃水浴皂化40 min至油滴消失，冷卻后加入3 mL BF3-MeOH（14%）溶液，65 ℃加熱20 min。流動水冷卻，加入2 mL正己烷和2 mL 0.88% NaCl溶液，渦旋15 s，3000 r/min離心5 min。取正己烷（AR）層，加少量無水硫酸鈉吸收殘余水分，氮氣濃縮后用1 mL正己烷復溶，0.22 μm濾膜過濾后進行GCMS分析。

進樣口溫度250 ℃，MS檢測器溫度280 ℃，分流比10:1，進樣體積1 μL。升溫程序：150 ℃保持0 min，以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持15 min。離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延遲時間2.5 min，開始時間3.0 min，結束時間60.0 min。脂肪酸相對含量的確定采用面積歸一化法計算。

1.2.6 薄層色譜分析 蛋黃PL提取物中含有PC、PE和少量脂肪等多種成分，參考劉穎等[36]的方法采用薄層層析法能夠有效地鑒定蛋黃PL的成分。展開劑配比為V （氯仿）:V （甲醇）:V （水）=65:25:4。取硅膠G板活化、密閉冷卻、點樣、展開，展開10 cm左右，取出吹干，碘蒸氣顯色。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010分析數據。使用SAS 9.1軟件通過單因素方差分析（ANOVA）比較平均值之間的差異。P＜0.05時具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 IgY的提取與純化

采用水稀釋法對IgY進行粗提取。如圖2所示，當稀釋倍數達到1:10時，蛋白質含量的上升趨勢減緩，可能是因為IgY為可溶性蛋白，其表面具有有較多的親水基團，當其與水接觸后會迅速吸水溶解，在稀釋倍數為1:10時大多數可溶性蛋白質已被水溶解完全，少數處于蛋黃顆粒部分的蛋白質難以溶解，故蛋白質含量上升減緩。

圖2 水稀釋倍數對WSF中蛋白質含量的影響Fig.2 Effect of dilution times on the content of proteins in WSF

IgY是一種水溶性蛋白質，常用鹽析法從WSF中提取。當單獨使用（NH4）2SO4時，上清液中仍有大量IgY[19]。對不同濃度（NH4）2SO4和NaCl組合對IgY粗提效率的影響進行了分析。如圖3A所示，當NaCl濃度為1.0%，（NH4）2SO4的濃度由30%增加到50%時，提取過程中IgY的純度顯著下降（P＜0.05），而得率則呈相反趨勢。圖3B顯示，1.0% NaCl與固定濃度（35%飽和度）（NH4）2SO4相結合時，IgY的純度最低。而當NaCl濃度增加至1.0%（w/v）時，IgY的得率最高。之后隨著NaCl濃度的增加，IgY的得率緩慢下降。這一現象可能是由于高鹽濃度下其他蛋白質的共沉淀作用導致的，這與AKITA等[17]的結果一致。綜合考慮純度和得率，選擇35%飽和（NH4）2SO4和0.5% NaCl（w/v）組合從蛋黃中粗提IgY。有研究表明在20%飽和（NH4）2SO4和15% NaCl（w/v）條件下，IgY的純度和產率分別提高到98.7%和80.9%。NaCl濃度為0.16 mol/L（0.94%）～1.5 mol/L（8.8%）時，漿質蛋白抑制了蛋黃顆粒的分離效果，加入高濃度的NaCl有利于IgY的沉淀[23]，而本研究在提取IgY過程中NaCl的使用量大大降低。

圖3 （NH4）2SO4濃度（A）和NaCl濃度（B）、PEG 6000濃度（C）對IgY純度和得率的影響Fig.3 Effect of the concentrations of （NH4）2SO4 （A）, NaCl（B） and PEG 6000 （C） on the purity and yield of IgY

采用PEG 6000（w/v）純化IgY的結果如圖3C所示。當PEG 6000濃度為8%時，IgY的純度最高，得率最低，純度和得率分別為97.38%和6.15 mg/mL蛋黃。由圖4A可以看出，在用35%（NH4）2SO4和1.0%氯化鈉（w/v）沉淀后，泳道3中在33 kDa附近仍然存在大量蛋白質，但用8% PEG 6000（w/v）進一步處理后，泳道4中的雜蛋白明顯減少，表明PEG 6000有助于IgY的有效分離。HPLC結果（圖4B）顯示，鹽析后IgY的純度為87.46%，經過PEG沉淀后純度提高到97.38%，表明鹽析和PEG的組合可有效純化IgY。

圖4 純化IgY樣品的SDS-PAGE圖譜（A）和HPLC圖譜（B）Fig.4 Diagram of SDS-PAGE （A） and HPLC （B） of purified IgY sample

2.2 PV的提取條件選擇

沉淀物B中PV主要通過磷鈣橋以卵黃高磷蛋白-高密度脂蛋白復合物的形式存在[7]。10% （w/v）NaCl通常用于破壞HDL和PV之間的磷鈣橋[28,37]。本文研究了pH對PV提取的影響。結果如表1所示，在pH5.0條件下，分離效果最好（PV純度為78.63%±0.88%，得率為10.17±0.29 mg/mL），這與REN等[38]的研究結果一致。當pH為5.0時，部分HDL析出，而PV仍存在于上清液中。隨著pH逐漸升高，偏離等電點，分子間靜電斥力增加，溶解度升高，故上清液中HDL含量增加，使得PV的分離效果下降。

PV有較好的耐熱性，極易溶于水，因此將鹽析和加熱處理結合可提高其純度[27,37]。由表1可知，當溫度從70 ℃升至80 ℃，PV純度由66.47%±4.01%顯著提高到78.08%±0.16%（P＜0.05）。而隨著溫度由80 ℃升至95 ℃，PV純度保持穩定，90 ℃時PV的純度最高。主要是因為隨溫度升高，部分雜蛋白逐漸變性析出，從而提高了PV純度。

表1 pH和溫度對PV純度的影響Table 1 Effects of pH and temperature on the purification of PV

由圖5A可以看出，泳道2上的PV樣品與泳道1上的PV標準品基本一致，與JIANG等[38]的結果一致。經過HPLC分析（圖5B），所得PV的純度為78.72%，得率為10.14 mg/mL。

圖5 純化PV樣品的SDS-PAGE圖譜（A）和HPLC圖譜（B）Fig.5 Diagram of SDS-PAGE （A） and HPLC （B） of purified PV sample

2.3 蛋黃油的提取條件選擇

鑒于蛋黃油由極性脂質和非極性脂質組成，因此本研究選擇極性和非極性溶劑（乙醇/乙酸乙酯）的組合來更好地提取沉淀A中的剩余脂質。圖6A表明，乙醇/乙酸乙酯比例為1:2（v/v）時產率最高，主要原因是蛋黃油含有約62%的中性脂質和33%的極性脂質[39]。據相似相溶原理，中性脂質在乙酸乙酯中有較好的溶解性，而PL較易溶于乙醇溶液中，因此當乙醇與乙酸乙酯的比例達到1:2時，恰好與蛋黃油中中性脂質與極性脂質的比例相同，從而使蛋黃油的產率達到最大。如圖6B所示，在相同的添加量下，通過乙醇溶劑提取的蛋黃油的產率明顯低于復合溶劑。在最佳條件下，本研究中蛋黃油產率最高為88.09%，得率為30.10 mg/mL，高于NIELSEN用乙醇提取所得結果[40]，表明新型混合溶劑乙醇/乙酸乙酯具有較高的提取效率。KOVALCUKS等[41]采用溶劑混合物乙醇/氯仿和2-丙醇/己烷進行蛋黃油的提取，得率分別為29.91 mg/mL和27.29 mg/mL。

圖6 蛋黃油產率的優化Fig.6 The optimization of egg yolk oil yield

2.4 PL的提取條件選擇

在提取蛋黃油的基礎上，進一步采用乙酸乙酯從蛋黃總脂中沉淀出PL。乙酸乙酯是一種非極性溶劑，具有價格低廉、低毒性、易揮發等特點。結果表明，溫度對PL提取率的影響較大，如圖7A所示，在-20 ℃下蛋黃總脂中PL的含量（the content of PL in lipids, CPLL）為31.43%，可能是因為低溫會降低PL的溶解度。而在-20 ℃下PL的純度為56.4%，遠低于4 ℃和0 ℃下的純度，可能是中性脂質在-20 ℃下共沉淀的結果。綜合考慮CPLL和純度，選擇0 ℃條件下沉淀PL。

圖7 PL提取效率的優化Fig.7 The optimization of PL extraction efficiency

圖7 B為乙酸乙酯對CPLL和PL得率的影響。所得PL的純度（約85.94%）與乙酸乙酯濃度沒有顯著差異。隨著蛋黃油中乙酸乙酯（w/v）比例的增加，CPLL顯著增加（P＜0.05）。在0 ℃，蛋黃油/乙酸乙酯為1:6（w/v）條件下，PL樣品的純度為85.94%，CPLL為35.18%。WANG等[9]用95%乙醇提取PL，最終純度為80%，表明乙酸乙酯提取可獲得純度較高的PL。結果表明，用乙酸乙酯提取PL具有較好的效果。PL樣品的薄層色譜分析如圖7C所示，表明所獲得的PL主要由PC和PE組成，且PC占了樣本的大部分。

2.5 脂肪酸組成分析

進一步對蛋黃總脂和PL中脂肪酸組成進行氣相色譜分析，結果如表2所示。由表2可知，兩種樣品中都存在8種脂肪酸。蛋黃總脂的脂肪酸組成具有最高的油酸含量（C18:1），其次是相同比例的飽和棕櫚油酸（C16:0）。脂肪酸含量由高到低依次為：單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid, MUFA）＞飽和脂肪酸（saturated fatty acid, SFA）＞多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）。PC的脂肪酸含量由高到低依次為：SFA＞MUFA＞PUFA，飽和脂肪酸含量由12.67%上升到24.41%，而總單不飽和脂肪酸含量明顯下降，可能是由于油酸（C18:1）含量的下降。PUFA/SFA比值和n-6/n-3比值都是人體營養膳食的重要誘導因子。已有研究表明，建議膳食中PUFA/SFA的比值大于0.4，n-6/n-3的比值不大于4[42-43]。表2中的數據表明PL具有合適的PUFA/SFA比值（0.70），蛋黃總脂和PL的n-6/n-3比值分別為12.6和5.37。本方法提取的PL樣品含有豐富且平衡的脂肪酸成分，是為人類營養提供平衡膳食的良好添加劑。

表2 蛋黃總脂和PL的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid compositions of total egg yolk lipids and phospholipids

3 結論

在不使用有毒溶劑的前提下，從新鮮的雞蛋黃中依次分離出IgY，PV和PL。采用了鹽析和PEG結合的新方法從WSF中純化IgY，以此獲得高得率、高純度的IgY樣品；用乙酸乙酯和乙醇作為復合溶劑，同時提取了PV和蛋黃油。在最佳條件下，PV和蛋黃油可以得到更大程度的分離；用冷凍非極性溶劑乙酸乙酯處理蛋黃總脂，得到了大量高純度的PL，且PL具有良好的PUSA/SFA比值，可作為食品工業添加劑。結果表明，本研究通過綠色高效連續分離技術能夠獲得純度、得率較高的IgY、PV和PL組分，該方法便捷、高效，在工業化生產中具有很大的應用潛力。