雪地茶甲醇提取物體外抑菌活性及其穩定性研究

任國媛，郭啟新，王 靜，丁海燕,

（1.大理大學公共衛生學院, 大理大學預防醫學研究所, 云南大理 671000；2.大理州質量技術監督綜合檢測中心, 云南大理 671000）

雪地茶（Thamnolia subuliformis（Ehrh.） W. Culb.）又名太白茶、石白茶，地茶科地茶屬植物，在云南地區主要分布于迪慶、麗江、大理蒼山等海拔4000 m以上的高寒地區，當地居民常以水煎服或泡茶飲用治療中暑、心煩口渴、肺熱咳嗽、咽喉腫痛、陰虛潮熱、癲癇、失眠、目疾、高血壓等癥[1]。近年來，雪地茶抗氧化、抗衰老、抗炎、減肥等功效[2-4]逐漸被報道，其廣泛的生理作用得益于它豐富的代謝產物[5]。雪地茶次生代謝產物來源于其共生菌，多為水不溶性，主要包括萜類、甾醇類以及乙酸酯-多聚丙二酸酯途徑形成的蒽醌類、縮酚酸類及其衍生物等，其中縮酚酸及其衍生物是地衣生物所特有的化學成分，如壩巴酸、松蘿酸、富馬原島衣酸、扁枝衣二酸等多種地衣酸都被證實具有良好的抑菌活性[6-9]。前人研究表明，雪地茶中包含甲基苔色酸、雪茶素、4-甲基-2,6-二羥基苯甲醛等19種酚酸、縮酚酸及衍生物[10]，然而其抑菌活性卻無人探究。隨著人們對飲食健康的重視，尋找、研究、開發新的毒副作用小的防腐劑已成為目前急需解決的問題。因此，本實驗以雪地茶為研究對象，探究其水和甲醇提取物的抑菌活性及外界環境因素對其抑菌穩定性的影響，為雪地茶開發成抗菌素和天然防腐劑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪地茶（Thamnolia subuliformis（Ehrh.） W. Culb.）采集于云南省香格里拉地區，經大理大學生藥學實驗室張德全副教授進行植物學鑒定后保存于4 ℃冰箱；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 25923）、枯草芽孢桿菌（Bacillus cereusATCC 6633）、斯氏李斯特菌（Listeria seeligeriCICC 21671）、甲型副傷寒桿菌（Salmonella paratyphi-A BNCC 336664）、乙型副傷寒桿菌（Salmonella paratyphi-B BNCC 103169）、白色念珠菌（Candida albicansATCC 10231）、表面葡萄球菌（Staphylococcus epidermidisATCC 12228）、伊氏李斯特氏菌（Listeria monocytogenesCICC 21663）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenesCMCC 21633）、大腸埃希菌（Escherichia coliCMCC（B）441027）、福氏志賀菌（ShigellaflexneriCMCC 21534）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniaeATCC 4352）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosaATCC 27853）、酵母菌（SaccharomycesBNCC 142268） 由大理州質量技術監督綜合檢測中心提供；營養瓊脂、LB肉湯等常規試劑 北京陸橋技術股份有限公司。

T6新世紀型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Scientz-ND型系列冷凍干燥機、SB-5200DTDN型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-3000型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；VS-1300L-U型超凈工作臺 蘇凈集團泰安公司制造；GHP-9270型隔水式恒溫培養箱、DKZ-3型震蕩水槽、HWS-28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；GZX-9160MBE型數顯鼓風干燥機 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；ZW20S19W型紫外燈 江陰市飛揚器械有限公司；4500Qtrap型質譜儀 美國AB SCIEX公司；Ultimate3000型超高效液相色譜儀 美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雪地茶提取物體外抑菌活性實驗

1.2.1.1 雪地茶提取物的制備 雪地茶甲醇提取物的制備：參考汪瓊等[11]的方法加以修改。雪地茶清洗經過鼓風干燥機50 ℃烘10 h后干燥至樣品變脆后粉碎，過60目篩。按照料液比1:10 g/mL加入75%甲醇溶液，超聲浸提30 min后抽濾，重復浸提后收集上清液，50 ℃旋轉蒸發至10 mL后-20 ℃冷凍3 h成固體，真空冷凍干燥12 h（冷阱溫度降到-25 ℃，真空度設置為50 Pa）成粉末，置于-20 ℃冰箱避光密封保存。

雪地茶甲醇分級提取物的制備：參考鄧云霞等[12]的方法加以修改。將兩次超聲提取的甲醇提取物上清液減壓濃縮至一定體積，使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積分別萃取，直至萃取劑無色。旋轉蒸發至10 mL后-20 ℃冷凍3 h成固體，真空冷凍干燥12 h（冷阱溫度降到-25 ℃，真空度設置為50 Pa）成粉末，置于-20 ℃冰箱避光密封保存。

雪地茶水提物的制備：參考付長華[13]的方法加以修改。取過60目篩粉碎好的雪地茶粉末，按料液比1:10 g/mL加入蒸餾水，80 ℃水浴浸提30 min，抽濾，重復浸提后收集上清液，50 ℃旋轉蒸發至10 mL后置于-20 ℃冷凍3 h成固體，真空冷凍干燥12 h成粉末，置于-20 ℃冰箱避光密封保存。

1.2.1.2 雪地茶提取物體外抑菌活性 采用平板打孔法[14]探究雪地茶提取物的體外抑菌活性，甲醇提取物使用甲醇進行溶解，水提物使用無菌水溶解。刮取斜面保存菌體于無菌蒸餾水中，采用麥氏比濁法，使用無菌水調整菌液濃度至106CFU/mL備用。將營養瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基和106CFU/mL的菌液，按每20 mL培養基中加入1 mL菌液比例混勻。用100 μL的槍頭在凝固的瓊脂上打孔，挑出孔內的瓊脂，每個孔中加入20 μL的100 mg/mL雪地茶提取物，陽性對照使用5 mg/mL的左氧氟沙星，陰性對照為水和甲醇。每組設置三個平行實驗，4 ℃擴散2 h后，置于37 ℃培養箱中，培養24 h觀察抑菌圈的形成。參考LI等[15]的研究對雪地茶抑菌活性進行判斷：抑菌圈直徑大于6 mm判斷為有抑菌活性，小于等于6 mm為無抑菌活性；3次重復實驗均達到有抑菌活性結果者判為合格；陰性對照組應無抑菌圈，否則實驗視為無效。抑菌圈直徑大于6 mm小于8 mm為低度敏感；大于8 mm小于14 mm為中度敏感；大于14 mm小于20 mm為高度敏感；大于20 mm為極度敏感。

1.2.2 雪地茶甲醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

1.2.2.1 最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）的測定 采用二倍稀釋法[16]，將20 mg甲醇提取物用3%二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO） 0.06 mL復溶制成待測液，用無菌LB肉湯稀釋樣品至一定濃度梯度（10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020 mg/mL）。不同濃度樣品接種2% （V/V）活化后的菌液（106CFU/mL），置于37 ℃110 r/min的恒溫培養箱振蕩培養24 h，以加入等體積的3% DMSO代替提取物作為空白對照。

1.2.2.2 雪地茶甲醇提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響 從斜面上刮取菌體，接種到5 mL新鮮的LB液體培養基中，37 ℃ 110 r/min振蕩培養至生長對數期，稀釋到106CFU/mL。總體積為30 mL，對照組為3% DMSO，實驗組為MIC（提取物的終濃度為0.625 mg/mL）和2 MIC（提取物的終濃度為1.250 mg/mL），迅速混勻置于37 ℃靜置培養。雪地茶提取物對金黃色葡萄球菌的生長影響實驗時間點選擇0、2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、33 h等13個時間點，以加入等體積的3% DMSO代替提取物作為空白對照，每組設置三次平行實驗，采用分光光度計600 nm檢測雪地茶提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響[17]。繪制吸光度-時間曲線，從而獲得金黃色葡萄球菌生長曲線的變化趨勢。

1.2.3 雪地茶抑菌活性的穩定性探究實驗

1.2.3.1 溫度對雪地茶甲醇提取物抑菌活性的影響參考YIN等[18]的方法并進行一定修改。將雪地茶甲醇提取物100 mg/mL原液分別在室溫（對照組，18 ℃）、40、60、80、100 ℃的水浴中處理30 min，采用1.2.1.2方法測定體外抑菌活性。

1.2.3.2 pH對雪地茶甲醇提取物抑菌活性的影響參考ZANGENEH等[19]的方法并進行一定的修改。分別用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH將雪地茶提取物100 mg/mL原液的pH調整為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，以未調節pH的提取物為對照（pH4.83），采用1.2.1.2方法測定抑菌活性。

1.2.3.3 短波紫外線對雪地茶甲醇提取物抑菌活性的影響 參照劉海燕等[20]的方法進行一定修改。將雪地茶甲醇提取物100 mg/mL原液置于紫外燈下（20 W，紫外燈距樣品25 cm）分別照射10、20、30、40、50 min，以未進行照射的提取物為對照，采用1.2.1.2方法測定抑菌活性。

1.2.4 雪地茶甲醇提取物中松蘿酸含量的測定

1.2.4.1 松蘿酸標品和樣品的制備 標準品的制備：精密稱取松蘿酸標準品0.0500 g，用50%甲醇水定容50 mL，得到濃度1000 μg/mL儲備液，用50%甲醇水分別稀釋成2、5、10、25、50、100、200 μg/L的標準曲線，制得標準曲線y=54121.4x-14121.9 （r=0.99966）。

樣品的制備：稱取樣品10.000 mg，用10%甲醇水定容至100 mL，再稀釋10倍得到待測液。

1.2.4.2 液相條件和質譜條件 超高效液質聯用法（Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS）條件：色譜柱Waters Acquility UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）,流動相A：水；B：甲醇；洗脫程序（以流動相B體積分數表示）：0～0.5 min，10%；0.5～2 min，10%～30%；2～7 min，30%～95%；7～9 min，95%；9～20 min，10%，流速0.3 mL/min，進樣量5.0 μL，柱溫40 ℃。質譜條件：離子源：電噴霧離子源負離子模式（ESI-）；離子噴霧電壓（Ionspray voltage）：-4500 V；氣簾氣（Curtain gas）：30 L/h；碰 撞 氣（Collision Gas）：Medium；脫溶劑溫度：550 ℃；霧化氣1（Ion Source Gas1）：50 L/h[21]。其他見表1。

表1 松蘿酸的UPLC-MS/MS測定參數Table 1 Determination parameters of usnic acid by UPLC-MS/MS

1.3 數據處理

每個處理重復三次，實驗結果以均值±標準偏差（Mean±SD）表示，數據采用Graphpad prism 8.0和SPSS 26.0軟件進行數據處理并分析，統計學方法采用單因素方差分析，P＜0.05表明具有顯著性差異，P＜0.01表明具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 雪地茶水提物和甲醇提取物的抑菌活性

本實驗以金黃色葡萄球菌為研究對象，探究雪地茶水提物和甲醇提取物的抑菌活性，如圖1所示，雪地茶水提物對金黃色葡萄球菌無明顯抑菌作用，而甲醇提取物則呈現出一定的抑菌作用。結果表明雪地茶的主要抑菌成分溶于有機溶劑甲醇，在水中的溶解度較小，這一結果與KOSANI?MARIJANA[22]、房敏峰等[23]研究結果一致，證實地衣類植物的多數抑菌成分難溶于水，易溶于有機溶劑。同時，汪瓊等[11]對雪地茶甲醇提取物的成分組成進行探究，發現其甲醇提取物中含有鱗片衣酸、壩巴酸、松蘿酸等物質，這些具有抗菌活性的地衣酸類物質均易溶于有機溶劑而不溶于水[24]，進一步佐證了本實驗結果。由圖2可知將雪地茶甲醇提取物進一步使用不同極性有機溶劑進行萃取，發現乙酸乙酯提取物的抑菌圈較大（17.2 mm），石油醚相無抑菌圈，正丁醇相有抑菌圈但相對較小（10.4 mm），因此推斷甲醇提取物中的抑菌成分基本鎖定在乙酸乙酯相中。

圖1 雪地茶提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of Thamnolia subuliformis extract on Staphylococcus aureus

圖2 不同有機溶劑提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of different organic solvent extracts on Staphylococcus aureus

在上述實驗結論的基礎上，進一步探究了雪地茶甲醇提取物對多種致病性革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、斯氏李斯特菌、表面葡萄球菌、伊氏李斯特氏菌、單增李斯特菌）、革蘭氏陰性菌（甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、大腸埃希菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌）以及真菌（白色念珠菌、酵母菌）的抑菌活性，結果如表2所示，單增李斯特菌、大腸埃希菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、酵母菌無抑菌效果，6種致病性細菌對雪地茶甲醇提取物高度敏感（抑菌圈直徑大于14 mm小于20 mm），且其敏感性排序為：金黃色葡萄球菌＞伊氏李斯特氏菌＞乙型副傷寒桿菌＞枯草芽孢桿菌＞斯氏李斯特菌＞甲型副傷寒桿菌，表面葡萄球菌、白色念珠菌為極度敏感（抑菌圈直徑＞20 mm），說明雪地茶甲醇提取物具有較為廣泛的廣譜抑菌效果，具有可開發為廣譜抑菌藥物和天然防腐劑的潛力。目前對地衣活性抑菌物質的抑菌機制研究較為深入的是松蘿酸，被證實可通過破壞致病微生物包膜物質的結構和功能、抑制其大分子生命物質的合成、抑制其正常的生理代謝等方面抑制病原微生物的生長和繁殖[25]。松蘿酸可以通過改變耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌體細胞膜通透性，干擾其蛋白質代謝來抑制細菌的生長，破壞其固有形態，在亞抑菌濃度就能夠抑制生物被膜的形成，對于白色念珠菌主要通過改變成熟菌體的生物膜厚度來發揮其抑菌作用[26]。MONIKA等[27]發現松蘿酸可以通過阻礙金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌RNA的合成來抑制細菌生長。然而對于雪地茶的抑菌活性及其機理暫無報道，為拓展其資源的開發利用，進一步闡明其抑菌作用機制十分必要。

表2 雪地茶甲醇提取物抑菌作用Table 2 Antibacterial effect of methanol extract from Thamnolia subuliformis

2.2 雪地茶甲醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

在確定了雪地茶甲醇提取物的抗菌活性后，實驗進一步以食品中常見且致病性較高的金黃色葡萄球菌為對象，對其MIC及MBC進行測定，結果表明（表3）雪地茶甲醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果較強，MIC和MBC分別為0.625和10 mg/mL。與其他中草藥相比，雪地茶甲醇提取物的作用濃度較低且抑菌活性較強，崔新潔等[28]對24種中藥的水提和醇提物進行抑菌活性研究，其中14種中藥提取物的MIC大于200 mg/mL，6種中藥的MIC在100～200 mg/mL，僅4種中藥的MIC小于100 mg/mL，其中活性最高的為五倍子水提液（MIC：0.390 mg/mL）。本實驗結果說明雪地茶甲醇粗提物的抑菌活性較高，具有較高的開發潛力，但其主要活性物質的鑒定及體內作用濃度還有待進一步探究。

表3 雪地茶甲醇提取物的最低抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of methanol extract of Thamnolia subuliformis

為進一步驗證雪地茶甲醇提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響，實驗采用MIC和2MIC的樣品濃度處理觀察其對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響（圖3）。在0～2 h內，對照和處理組菌體的生長速率無顯著差別，2～8 h對照組菌體進入對數期，8 h以后基本處于穩定期；而加樣處理組的菌體在2～33 h生長速率明顯較慢，且濃度越大，抑制效果越明顯，該現象與高飛雄等[29]用植酸處理沙門氏菌的生長曲線相似。說明樣品中某些物質的存在抑制了金黃色葡萄球菌的正常生長繁殖，使其菌體數量顯著下降；導致菌體對數生長期縮短、生長速率緩慢，從而達到抑菌作用。

圖3 雪地茶甲醇提取物對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig.3 Effect of methanol extract of Thamnolia subuliformis on growth curve of Staphylococcus aureus

2.3 雪地茶甲醇提取物抑菌活性的穩定性探究

2.3.1 溫度對雪地茶甲醇提取物的抑菌活性影響為探究雪地茶甲醇提取物的抑菌穩定性，實驗采用不同溫度、pH和紫外照射處理雪地茶甲醇提取物，結果見圖4。由圖4A可知，雪地茶甲醇提取物經不同溫度處理后，與對照相比其抑菌活性沒有顯著差異(P＞0.05)，即使用100 ℃高溫處理30 min后也保持較高的抑菌活性，說明雪地茶甲醇提取物有較好的熱穩定性。地衣類生物可能存在的潛在抑菌活性物質酚酸類物質的熔點沸點較高，在100 ℃下的溫度不易發生分解[30]，因此常規操作溫度更不會對其造成影響。另外，其他中草藥中獲取的多種抑菌物質也是一樣，丁香提取物和訶子的水提物在高溫處理下，也不會影響其抑菌效果[31-32]。雪地茶甲醇提取物的熱穩定性是其后續資源開發利用的前提和保障。

2.3.2 pH對雪地茶甲醇提取物的抑菌活性影響 雪地茶甲醇提取物對供試菌在較寬的pH范圍內都有抑菌活性，但是隨pH的變化有所波動（圖4B），具體表現為隨著處理pH的升高（2.0～10.0）其抑菌活性先升高后降低，當pH為6.0時（接近其本身pH4.83）時抑菌活性達到最大。在酸性條件（pH2.0、4.0）下，其抑菌活性較對照組分別降低34.15%和23.17%，堿性條件下（pH8.0、10.0）其抑菌活性較對照組下降了26.83%和35.98%。本實驗結果表明外界pH影響雪地茶甲醇提取物的穩定性，在弱酸環境下，其抑菌活性較為穩定，此結果與酚類物質的酸堿穩定性結果相一致[33]，在堿性環境下，其潛在的抑菌活性物質酚酸類化合物的酚羥基被破壞，水解生成醌類物質，導致其抑菌活性降低[34]。

圖4 溫度、pH、紫外線對雪地茶甲醇提取物抑菌活性的影響Fig.4 Effects of temperature, pH and UV on the antibacterial activity of methanol extract of Thamnolia subuliformis

2.3.3 紫外線對雪地茶甲醇提取物的抑菌活性影響不同紫外照射時間對雪地茶甲醇提取物的影響見圖4C，與對照相比，當處理時間為10、20、30 min時，其抑菌活性比較穩定，但隨著處理時間的延長（40、50 min），其抑菌活性略有下降，但仍為對照組的90%以上。前人研究表明，一些功能性植物提取物如原花青素[35]、黃酮[36]、多酚[37]等物質在長時間紫外輻射的環境中其含量持續降低，說明目標物質發生了分解。結合本實驗研究結果，推測雪地茶甲醇提取物中的抑菌活性成分經紫外線處理后受到了一定的破壞。

2.4 雪地茶甲醇提取物中松蘿酸的含量測定

由圖5和圖6可知，雪地茶甲醇提取物中的松蘿酸含量為0.8613%，其乙酸乙酯萃取物中的松蘿酸含量為0.9379%，乙酸乙酯萃取物中松蘿酸的含量高于甲醇提取物中的松蘿酸含量。乙酸乙酯提取物的抑菌圈也大于甲醇提取物，但二者之間是否有必然聯系，還需進一步的分離純化來驗證抑菌活性。

圖5 雪地茶甲醇提取物中松蘿酸的定量離子MRM圖Fig.5 Quantitative ion MRM diagram of usnic acid in methanol extract of Thamnolia subuliformis

圖6 雪地茶乙酸乙酯萃取物的松蘿酸定量離子MRM圖Fig.6 Quantitative ion MRM diagram of usnic acid in ethyl acetate extract of Thamnolia subuliformis

3 討論與結論

本研究制備雪地茶甲醇粗提物的目的是得到包含更多有效抑菌成分的提取物，對于雪地茶是否具有抗菌作用及抗菌穩定性進行初步探索。結果顯示，雪地茶甲醇提取物具有較好的抑菌活性，水提物無抑菌活性，說明雪地茶抑菌活性物質主要溶于甲醇，并且甲醇提取物具有廣譜的抑菌效果，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌都有抑菌活性，其抑菌機理有待進一步研究。以金黃色葡萄球菌為指示菌，探究其抑菌穩定性，熱處理對雪地茶提取物的抑菌活性無明顯影響；pH在接近強酸和強堿時，提取物抑菌活性呈極顯著下降趨勢（P＜0.01），但仍然有抑菌活性；紫外照射在40 min以上，抑菌活性也會略微下降。結果表明食品加工過程中，常見的熱處理不會對其抑菌活性產生影響，在紫外光滅菌處理時，盡量不超過30 min。其抑菌活性物質在溫度、pH、紫外線的照射的影響下，都比較穩定。進一步對甲醇提取物進行分級萃取，發現抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取物中，根據前人研究以松蘿酸為代表的縮酚酸及其衍生物可能為抑菌主要活性成分[7]，測定甲醇提取物及乙酸乙酯萃取物中的松蘿酸含量，乙酸乙酯提取物的抑菌圈直徑大于甲醇提取物直徑，乙酸乙酯提取物中的松蘿酸含量大于甲醇提取物的含量，推測抑菌活性可能與松蘿酸含量有關，但需要進一步分離純化驗證。本研究為雪地茶甲醇提取物應用于食品防腐、抑菌提供了理論依據，目前對于雪地茶抑菌的研究甚少，本研究為雪地茶抑菌活性物質的分離純化、抑菌機理的探究提供了數據支撐。