一種新型綿羊乳酪蛋白ACE抑制肽結構鑒定及分子結合機制分析

湯海霞，王爽爽，郝 果，宋宇軒，張 磊，葛武鵬,

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院, 陜西楊凌 712100；2.陜西省羊乳產品質量監督檢驗中心, 陜西富平 711700；3.西北農林科技大學動物科技學院, 陜西楊凌 712100）

高血壓以體循環動脈血壓（收縮壓或舒張壓）升高為主要特征（收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg）。高血壓病人會出現清晨頭痛、流鼻血和耳朵嗡嗡作響等癥狀，如果不及時治療，會導致持續的胸痛（也稱為心絞痛）、心臟病發作、心力衰竭和心律不齊，從而導致猝死[1]。血管緊張素轉換酶（Angiotensin-I-Converting Enzyme，ACE）是血管緊張素系統中的一種關鍵酶，可以催化血管緊張素Ⅰ轉化為具有強大的血管收縮作用的血管緊張素Ⅱ，并且使具有降血壓作用的緩激肽失活[2]。因此，可以通過抑制ACE活性來治療高血壓。血管緊張素轉換酶抑制劑（Angiotensin-I-converting enzyme inhibitors，ACEI）已被廣泛研究用于預防和控制高血壓。但人工合成的ACEI具有不良副作用，例如持續性干咳、皮疹和味覺障礙等[3]。為了解決上述問題，越來越多的學者開始聚焦于天然來源的ACE抑制肽研究，目前人們已經從乳[4]、豌豆[5]、雞蛋[6]、刺參[7]和紅松仁[8]等天然食物中分離得到ACE抑制肽。

很多研究已經從不同乳源來源的酪蛋白中分離得到ACE抑制肽，例如，CHEN等[9]使用復合蛋白酶水解牛乳，鑒定得到2條新的ACE抑制肽VLPVPQ和VAPFPE；ESPEJO-CARPIO等[10]利用枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶水解羊乳酪蛋白，結果發現1條新ACE抑制肽WY。UGWU等[11]將胃蛋白酶和胰蛋白酶混合分別水解駝乳和馬乳來源的酪蛋白，得到的酪蛋白水解液有顯著的ACE抑制率。我國綿羊乳產量位居世界第二位，綿羊乳中酪蛋白平均含量為4.5%，乳清蛋白僅占1%左右[12]，目前關于綿羊乳酪蛋白的研究較少。酶解法因其設備要求簡單，條件溫和易于控制并且可以根據蛋白酶的酶切位點得到特定的肽類等特點，常用于活性肽的制備[13]。

因此，本文首次以綿羊乳酪蛋白為原料制備ACE抑制肽，為開發綿羊乳降血壓功能性食品提供了理論依據及技術參考。本文選擇堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K水解綿羊乳酪蛋白，篩選ACE抑制率最高的酪蛋白水解物進行氨基酸結構鑒定，最后采用Linewaver-Burk作圖和分子對接模擬對肽段抑制機理進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綿羊乳 采自甘肅省金昌奶綿羊試驗示范基地；胰蛋白酶（2500 U/mg） 上海源葉公司；蛋白酶K（40 mAnsom U/mg） 德國默克公司；堿性蛋白酶（2.4LFG） 諾維信公司；胃蛋白酶（≥250 U/mg）、鄰苯二甲醛（OPA）、L-絲氨酸 北京索萊寶有限公司；馬尿酸-組氨酸-亮氨酸（HHL） 上海麥克林公司；血管緊張素轉換酶（ACE≥2.0 U/mg）、乙腈 色譜級，美國Sigma公司。

?KTA蛋白純化系統 美國GE公司；5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；LGJ-25C真空冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；LTQ Orbitrap Velos 賽默飛世爾科技；1100型高效液相色譜 美國Agilent公司；UV-1900紫外分光光度計 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離制備綿羊奶酪蛋白 綿羊乳離心脫脂（5000 r/min，15 min，4 ℃）重復兩次，用2 mol/L的HCl調節pH至4.2，室溫靜置30～60 min后離心（4700 r/min，10 min，4 ℃）棄上清液，得到的沉淀即為酪蛋白粗品，依次用酸性水（pH4.2）清洗3次，用蒸餾水清洗3次[14]，然后進行真空冷凍干燥。

1.2.2 蛋白酶的篩選 將綿羊乳酪蛋白粉末配成底物濃度為5%的溶液，調節溶液到每種酶的最適酶解條件（蛋白酶K，pH7.5，37 ℃；堿性蛋白酶，pH7.0，55 ℃；胃蛋白酶，pH3.0，37 ℃；胰蛋白酶，pH8.0，37 ℃），試驗前期查閱文獻[15]，綜合考慮選擇酶添加量為3%，用1 mol/L NaOH維持酶解體系的pH不變，反應1 h取一次樣品，在95 ℃下滅活15 min，冷卻至室溫調pH到7.0，離心（10000 r/min，15 min，4 ℃）取上清液，測定樣品的水解度和ACE抑制率。

1.2.3 綿羊乳酪蛋白水解液水解度的測定 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的測定采用OPA法[16]。向1 mL的OPA試劑（40 mg OPA溶解在1 mL的甲醇中，加入0.95 g的四硼酸鈉，0.5 g的SDS，100 μL的β-疏基乙醇，去離子水定容到50 mL）中加入100 μL的絲氨酸標準液（濃度為0.9516 meqv/L）、樣品和去離子水渦旋5 s，室溫避光條件下精確反應2 min后在340 nm下測吸光度（OD）。DH的計算方程如式（1）～式（3）：

式中：Serine-NH2：每克蛋白中Serine-NH2的量；V：樣品的總體積；N：樣品的稀釋倍數；X：樣品的質量；P（%）：樣品中蛋白質的含量。

式中：h：樣品水解過程中每克酪蛋白被斷裂的肽鍵數；α、β：是常數分別為1.039、0.383。

式中：htot：每克酪蛋白所含的總肽鍵數為8.2。

1.2.4 ACE抑制率的測定 ACE抑制率的測定在CUSHMAN等[15]的方法上稍作修改。向離心管中加入10 μL樣品和30 μL 2.5mmol/L HHL，37 ℃培養5 min，加入20 μL的50 mU/mL ACE，37 ℃振蕩培養60 min，加入60 μL的1 mol/L HCl終止反應。HHL釋放的馬尿酸（HA）濃度通過HPLC測定。通過公式4計算

式中：ΔAControl和ΔAsample分別代表空白（緩沖液）和樣品中HA的峰面積。

HPLC檢測條件：分析柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流速：0.5 mL/min；上樣量：10 μL；流動相A：含有0.05% TFA的超純水；流動相B：乙腈；洗脫條件：78%流動相A和22%流動相B等度洗脫30 min；檢測器波長：228 nm。

1.2.5 酪蛋白酶解液中分子量的測定 將冷凍干燥后的多肽樣品配成濃度為20 mg/mL的溶液，過0.22 μm的濾膜，試驗采用?KTA pure 100蛋白純化系統，分離凝膠柱為：SuperdexPeptide10/300GL柱（300 mm×10 mm，GE公司）。洗脫條件：流動相:乙腈:水:三氟乙酸=30:70:0.1 （v/v），上樣量：500 μL，流速0.5 mL/min，檢測波長為220 nm。同時，選擇牛乳白蛋白 （6800 Da）、α-乳白蛋白 （14186 Da）、維生素B12（1355 Da）、氧化型谷胱甘肽（612.63 Da）、甘氨酸（75 Da）為標準品測定標準曲線，標準曲線方程為：y=-0.1192x+7.2412（R2=0.9963）。

1.2.6 綿羊乳酪蛋白酶水解液超濾分離 使用10 kDa和3 kDa的超濾管在4 ℃對酪蛋白水解液進行初步分離，獲得＞10 kDa、10～3 kDa、＜3 kDa 3個組分，冷凍干燥后測各組分ACE抑制活性的IC50。

1.2.7 酪蛋白酶解液中肽段結構鑒定 將小于3 kDa組分的多肽粉末重新溶解在0.1%三氟乙酸中，用Thermo-DionexUltimate3000高效液相色譜和LTQOrbitrapVelos質譜儀分析多肽結構。分析柱是石英毛細管柱（15 mm×75 μm）；流動相A為含有0.1%甲酸的水，流動相B含有0.1%甲酸和80%乙腈的水；梯度洗脫程序為0～2 min，8%～18%B；2～32 min，18%～35%B；32～34 min，35%～100%B；34～42 min，100%B；進樣量：6 μL；流速：0.3 μL/min，全掃描質譜（350～1500 m/z，60000分辨率）。

1.2.8 化學合成ACE抑制肽及其IC50的測定 篩選和預測的潛在的ACE抑制肽在上海生工生物工程股份有限公司采用固相合成法進行合成，經高效液相色譜法驗證，該肽的純度≥98%。將合成的肽配成濃度為2、5、10、15、25 μmol/L的溶液，按照1.2.4的方法測定肽的ACE抑制率。

1.2.9 ACE抑制動力學測定 使用1/V和1/HHL的Linewaver-Burk做圖分析KYIPIQY對血管緊張素轉換酶抑制模式，方法在SUTOPO等[17]基礎上稍有修改。將KYIPIQY（0、3、8 μmol/L）和不同濃度的HHL（0.5、2、2.5、3.5 mmol/L）與ACE按1.2.4方法混合培養，測定馬尿酸的含量，根據主圖的Y軸和X軸截距計算Vmax和Km。

1.2.10 分子對接肽KYIPIQY的結構 由Discovery-Studio2019clien軟件生成，用CHARMm力場對配體進行能量最小化；從RCSB蛋白質數據庫下載ACE晶體結構（代碼：1O8A，PDB），用軟件中的Clean-Protein模塊對ACE進行加氫、去水處理，定義活性坐標為（X: 38.977，Y: 38.645，Z: 50.183），對接半徑為 10?，選擇程序CDOCKER進行半柔性分子對接[18]，根據對接結果中“-CDOCKEREnergy”和“-CDOCKERInteractionEnergy”的值確定肽與ACE結合最佳方式，然后分析肽與ACE的相互作用位點和相互作用力類型評估分子對接的結果。

1.3 數據分析

所有數據重復三次并采用Origin 2018進行數據分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 最適蛋白酶的篩選

在一定范圍內，水解度的大小與蛋白質水解釋放的肽段含量成正比，蛋白質的水解程度影響著水解產物的功能和生物活性，因此測定酶解過程中水解物的水解度具有重要意義。圖1a顯示，四種蛋白酶在水解60、120、180 min后酪蛋白水解液的水解度都隨著酶解時間的延長而增大，水解度在2.02%和16.69%之間。其中堿性蛋白酶的綿羊乳酪蛋白水解液的水解度最大，胰蛋白酶和蛋白酶K沒有顯著差異（P＞0.05），胃蛋白酶的酪蛋白水解液的水解度最小。四種蛋白酶的酪蛋白水解液的水解度的顯著差異（P＜0.05）可能與酶促反應的速率或酶和底物親和力的特定作用有關[19]。

4種蛋白酶在不同水解時間獲得的水解產物的ACE抑制率為78.3%至94.3%（圖1b）。除蛋白酶K的酪蛋白水解液ACE抑制率最大值在60 min為92.6%，其余3種蛋白酶的酪蛋白水解液的ACE抑制率都隨著酶解時間的延長呈現出先增大后減小的趨勢，這些結果表明，酶處理的程度影響水解物的ACE抑制率，與舒國偉等[20]使用蛋白酶水解山羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽結果類似，可能是肽段的分子量在酪蛋白水解液降血壓中發揮重要作用。堿性蛋白酶120 min的ACE抑制率最大為94.3%。因此，試驗測定了四種酪蛋白水解物在不同水解時間的分子量分布，結果如圖1c所示，雖然所有水解產物中仍含有＞10 kDa的蛋白，但與未水解的酪蛋白對比，蛋白質分解明顯，并且隨著酪蛋白水解液水解度的增大小分子肽逐漸分解，將具有ACE抑制活性的肽逐漸水解為不具有ACE活性的肽段，導致酪蛋白水解液的抑制活性降低。

圖1 不同蛋白酶水解對酪蛋白水解度（a）、ACE抑制率（b）和分子量分布（c）的影響Fig.1 Effects of different proteases on degree of hydrolysis （a）,ACE inhibition rate （b） and molecular weight distribution（c） of casein hydrolysate

2.2 不同分子質量酪蛋白肽組分對ACE抑制率的影響

使用超濾管對J120 綿羊乳酪蛋白水解液進行截留，得到組分I（＞10 kDa）、組分II（3～10 kDa）和組分III（＜3 kDa），冷凍干燥后配成濃度800 μg/mL的溶液測ACE抑制率。結果如圖2所示，各組分均有ACE抑制活性，但隨著組分分子量減小，ACE抑制率增高，其中組分III的ACE抑制率為84.5%。馬瑩等[21]用超濾管對乳清蛋白水解液進行超濾分離，顯示＜3 kDa組分的ACE抑制活性最高。本研究結果與YU等[22]的研究結果相一致，相比于大分子量的多肽，小分子量的多肽顯示出更高的ACE抑制活性。因此選擇＜3 kDa的組分進行下一階段實驗。

圖2 不同分子質量多肽組分對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of casein peptides with different molecular weights on ACE inhibition rate

2.3 ACE抑制肽質譜鑒定分析

使用LTQOrbitrapVelos質譜儀對小于3 kDa的組分進行肽鑒定，共鑒定出411條肽段，其中源自αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白分別為84、116、137和74，表1列出了分子量小于1300 Da的肽，經過在BIOPEP和SwePep數據庫搜索比對，發現已經驗證ACE抑制活性的肽段有19條，是酪蛋白水解液具有高ACE抑制率的主要原因。

表1 酪蛋白水解物肽譜的質譜鑒定Table 1 Identification of peptide spectrum of casein hydrolysate by mass spectrometry

通過閱讀文獻發現，當一條肽段含有ACE抑制活性肽的片段，那么這條肽段也可能具有ACE抑制活性。例如，KAI等[23]證明了來自牦牛κ-酪蛋白的肽KYIPIQ具有ACE抑制活性，其IC50為7.8 μmol/L；同樣GóMEZ-RUIZ等[24]用蛋白酶水解綿羊乳酪蛋白得到κ-酪蛋白肽YIPIQY也顯示了抗高血壓的功能，ACEI的IC50為10.0 μmol/L。新鑒定的7肽KYIPIQY來源于目前的酪蛋白水解物，包含具有ACEI活性的片段，即KYIPIQ和YIPIQY。因此，7肽-KYIPIQY極有可能具有ACE抑制活性，為了驗證此肽段是否具有ACEI活性，試驗選擇KYIPIQY進行人工合成肽。圖3為其二級結構。

圖3 KYIPIQY的二級質譜圖Fig.3 Secondary mass spectra of KYIPIQY

2.4 ACE抑制肽活性的IC50值測定

采用高效液相色譜法測定了7-KYIPIQY的ACEI活性和IC50值。不同濃度肽的ACEI活性如圖4所示。IC50值由回歸方程確定：Y =（-0.08811）X2+4.04501X+29.69037（R2=0.999）。結 果 表 明，KYIPIQY是一種新穎高效的ACE抑制肽，其IC50值為5.73 μmol/L，活性明顯高于從酪蛋白中鑒 定 的ACEI肽LLYQEPVLGPVR（IC50=274.0±5.0 μmol/L）[25]和MVPYPQR（IC50=30 μmol/L）[26]。

圖4 KYIPIQY的ACE抑制活性Fig.4 ACE inhibitory activity of KYIPIQY

2.5 肽段KYIPIQY的抑制類型

通過Linewaver-Burk圖分析7肽KYIPIQY對血管緊張素轉換酶的抑制模式。如表2所示，Vmax值隨著肽濃度的增加而降低，說明ACEI肽可能阻斷了底物與ACE活性位點的結合。隨著ACEI濃度的增加，Km值升高，這表明更高濃度肽段有利于ACE催化反應。圖5顯示ACEI肽表現出混合類型的酶抑制模式，表明7-KYIPIQY可以與血管緊張素轉換酶的活性和非活性位點的位置結合，降低了血管緊張素轉換酶的催化活性，達到降血壓的作用。類似的，從南瓜子中分離鑒定的肽段RFPLL也為混合抑制模式[27]。

圖5 KYIPIQY對ACE的Lineweaver-Burk圖Fig.5 Lineweaver-Burk plot of ACE inhibition by the peptide LFRQFY

表2 KYIPIQY在不同濃度下的Vmax和KmTable 2 2Vmax and Km of KYIPIQY at different concentrations

2.6 KYIPIQY與ACE的分子對接分析

分子對接是通過計算相互作用能和分子間作用力來預測配體與受體活性位點的低能結合模式的有效方法[28]。為了進一步解釋KYIPIQY的ACEI機制，通過DiscoveryStudio2019 軟件對抑制肽和ACE進行了分子對接，形成的ACE-KYIPIQY復合體的三維結構、局部圖、2D圖如圖6所示。分子對接結果中-CDOCKER_Energy表示肽和ACE之間緊密結合強度，表3所示，KYIPIQY的-CDOCKER_Energy大于KYIPIQ和YIPIQ，顯示出更高的親和力，這表明KYIPIQY可能比其他兩肽發揮更高的ACE抑制作用，它們的ACE抑制的IC50值證明了推測。ACE的三個主要的活性位點口袋，分別是S1（Ala354、Glu384和Tyr523殘基）、S2 （Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520殘基）和S1’（Glu162）[29]。此外，Zn2+也是ACE活性位點，與ACE殘基His383、His387和Glu411形成四面配位體，在ACE和抑制劑之間的結合親和力中起重要作用[30]。在表4中，KYIPIQY與ACE殘基共形成10個氫鍵，10個疏水作用力和兩個靜電力，研究表明氫鍵是維持 ACE 與抑制肽結合的主要作用力，疏水作用力和靜電力也有助于ACE-結合肽的穩定[31]，KYIPIQY與ACE的S1和S2活性口袋中的Ala354和His353形成2個氫鍵和3個疏水作用力，表明KYIPIQY能與 S1和S2口袋形成緊密的結合，與 ACE 殘基His383、His387 和 Glu411之間形成3個氫鍵和一個疏水作用力可能會導致四面體配位的 Zn2+的扭曲，造成 ACE 催化活性的失活[32]而發揮高效的ACE抑制活性。

圖6 KYIPIQY與ACE的分子對接結果Fig.6 Molecular docking results of KYIPIQY and ACE

表3 KYIPIQY、KYIPIQ和YIPIQY與ACE分子對接評分Table 3 “-CDOCKER ENERGY” of KYIPIQY、KYIPIQ and YIPIQ

表4 ACE-KYIPIQY復合物在最佳構象中觀察到的氫鍵以及靜電和疏水相互作用Table 4 Hydrogen bonds and electrostatic and hydrophobic interactions observed in the best peptide poses based on the ACE-KYIPIQY complex

3 結論

試驗通過堿性蛋白酶水解綿羊乳酪蛋白得到的水解液的ACE抑制率為94.3%±0.86%，在體外展現出極高的ACE抑制活性。然后通過LTQ Orbitrap Velos質譜儀從酪蛋白水解液中鑒定出一種新的ACEI肽，KYIPIQY（源自κ-酪蛋白）顯示出強有力的ACEI活性，IC50值為5.73 μmol/L，并對ACE具有混合型抑制作用。此外，分子對接模擬表明KYIPIQY與ACE的S1、S2的活性口袋氨基酸殘基形成強結合力,并與Zn2+的四面配位體ACE殘基形成3個氫鍵導致四面體配位的 Zn2+的扭曲，進而造成 ACE 催化活性的失活，而展現出顯著的體外降血壓活性。本研究表明綿羊乳酪蛋白是制備食源性降血壓肽的極佳原料，可為綿羊乳新型功能食品的開發和抗高血壓保健品提供理論依據和指導。