中強電場對α-淀粉酶水解玉米淀粉的影響

蔣黎明，陶 陽，韓永斌，李丹丹

（南京農業大學食品科技學院全谷物食品工程研究中心, 江蘇南京 210095）

淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉[1]。直鏈淀粉是主要由α-1,4-糖苷鍵形成的線性聚合物，支鏈淀粉則由95%的α-1,4-糖苷鍵和5%的α-1,6-糖苷鍵形成的多分支結構構成[2]。淀粉除了作為生命體的主要供能物質外，它還具有可食用性、可降解性、可開發性等多種特性，成為了食品、制藥、造紙、紡織和生物塑料等行業中最常用的材料之一[3]。然而，天然淀粉難溶于冷水、熱穩定性差、淀粉糊粘度大、易回生等特性極大地限制了其加工應用。酶促水解是一種高效的綠色方法，可以將淀粉降解為可溶于水的、低粘度的小分子物質。其中，α-淀粉酶是應用最為廣泛的淀粉酶，可以從淀粉分子內部切開α-1,4-糖苷鍵，生成糊精和還原糖，在釀造、發酵、糧食加工、紡織品等工業中應用廣泛[4-6]。但是，淀粉分子通常以顆粒堆積的方式形成，內部結構致密，限制了淀粉酶對其的親和力。因此，探尋一種能夠增強α-淀粉酶水解淀粉的技術手段具有必要性。

電場處理是一種新興的食品加工技術。諸多研究證實電場處理可改善酶的活性。例如，OHSHIMA等[7]發現，利用電場強度12～13 kV/cm的脈沖電場處理過氧化物酶、轉化酶、葡糖淀粉酶、烯醇酶、β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶時，這些酶活性可提高5%～25%。LU等[8]進行響應面法優化交變電場處理下人參皂苷Rb1的實驗發現，在電場強度15 kV/cm、頻率8 Hz和酶濃度3%（w/w）時，β-葡萄糖苷酶活性達到初始酶活性的125%、人參皂苷Rb1轉化為Rd的得率達91.42%。SAMARANAYAKE等[9]利用電場（1 V/cm，1 Hz～1 MHz）處理α-淀粉酶發現，當頻率為1～60 Hz時，酶活性最高可提高41%。DURHAM等[10]發現電場在低溫條件下可改善纖維素酶的活力，但在高溫條件下將降低其熱穩定性。這些研究證實了電場技術在淀粉酶法改性中的應用潛力。然而，關于電場強化淀粉酶法改性的報道卻極少。僅有LI等[11]和VARELLA等[12]初步證明了電場技術用于強化淀粉酶解的可能性，其作用機制尚不明確。因此，本文以玉米淀粉為原料，利用中強電場輔助α-淀粉酶水解玉米淀粉，探究不同電場強度、頻率、緩沖液濃度、酶添加量等處理條件下玉米淀粉的酶解情況，并通過掃描電子顯微鏡、X-射線衍射儀、差示掃描量熱儀和熱重分析儀對酶解淀粉的顆粒形貌、結晶性質和熱特性等進行分析研究，從而為新型淀粉加工方法和淀粉基材料開發應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 沈陽蕾心有限公司；高溫α-淀粉酶（產自地衣芽孢桿菌，酶活力20000 U/mL，最適反應pH5.0～6.5）、DNS試劑 上海源葉生物試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

KHD-1100單相輸出500VA變頻電源 寧波凱華德電子科技有限公司；HP33120A紫外可見分光光度計 南京菲勒儀器有限公司；DT-810紅外測溫儀 深圳華盛昌科技實業股份有限公司；ST300C便攜式電導率儀 奧豪斯儀器（常州）有限公司；EVOLS10掃描電子顯微鏡 德國卡爾·蔡司股份有限公司；D2PHASER X射線衍射儀 美國Bruker儀器公司；Q20差氏掃描量熱儀 美國TA儀器公司；TG/DTA7200熱重分析儀 日本日立公司；FreeZone 6L冷凍干燥機 美國LANCONCO公司；GL-20GH高速離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 電場處理 電場處理方法參考LI等[11]的報道，略有修改。準確稱量5.00 g玉米淀粉于三角瓶中，與一定濃度的50 mL磷酸緩沖液（pH6）混合均勻后，向其中加入一定量的α-淀粉酶，插入電極片進行電場處理。電極片材料：鉑；電極片尺寸：20 mm×20 mm×2 mm；電極片間距離：20 mm。電場處理過程中，利用DT-810紅外測溫儀在線監測反應體系的溫度變化曲線，每min記錄一次。

1.2.2 電場強度對還原糖含量的影響 5.00 g玉米淀粉與50 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6）、5%α-淀粉酶混合均勻后，在電場強度0、1、2.5、5、7.5、10、15 V/cm和電場頻率50 Hz條件下處理30 min。電場處理結束，用0.2 mol/L NaOH將混合液pH調節至10進行滅酶處理后，用0.2 mol/L HCl將混合液pH調節至6～8，在轉速5000 r/min條件下離心10 min。取離心后的上清液進行還原糖的測定。離心得到的沉淀物經純水洗滌三次后，凍干，貯藏于干燥器中備用。

1.2.3 電場頻率對還原糖含量的影響 固定電場強度5 V/cm（1.2.2的優化條件），調控電場頻率50、60、100、200、400 Hz，其他條件同1.2.2。

1.2.4 緩沖液濃度對還原糖含量的影響 固定電場強度5 V/cm（1.2.2的優化條件）、電場頻率50 Hz（結合1.2.3結果和國內交流電常用頻率），調控緩沖液濃度0.02、0.05、0.1和0.2 mol/L，其他條件同1.2.2。

1.2.5 酶液比對還原糖含量的影響 固定電場強度5 V/cm（1.2.2的優化條件）、電場頻率50 Hz（結合1.2.3結果和國內交流電常用頻率）、緩沖液濃度0.1 mol/L（1.2.4的優化條件），調控酶液比1%、2%、3%、4%和5%，其他條件同1.2.2。

1.2.6 電導率的測定 利用電導率儀在25 ℃時測定濃度為0.02、0.05、0.1和0.2 mol/L的磷酸緩沖液的電導率，溫度補償值設定為2%[13]。

1.2.7 還原糖含量的測定 采用DNS法測定水解產生的還原糖濃度[14-15]。移取2 mL上清液于25 mL試管中，加入2 mL DNS試劑，于沸水浴中加熱5 min后，迅速置于冰水浴中冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，在540 nm波長下檢測吸光值。還原糖含量根據標準曲線y=0.9774x-0.014（R2=0.9981）進行計算。

1.2.8 掃描電鏡觀測（SEM） 測定方法參考文獻報道，略有修改[13]。首先在載物盤上粘上雙面膠帶，取少量酶解淀粉粉末放在膠帶中心部位，然后用洗耳球吹去粘結不牢的粉末，真空噴金后，用掃描電鏡對粉末表面形態進行觀察（加速電壓為5000 V；放大倍數3000×和200×）。

1.2.9 X-射線衍射分析（XRD） 測定方法參考文獻報道，略有修改[13]。將玉米淀粉置于盛有飽和食鹽水的干燥器中7 d，平衡水分。之后，利用XRD分析淀粉的結晶結構，測定條件為：Cu Kα輻射，管壓40 kV，管流40 mA，掃描速度4 °/min，掃描范圍（2θ）4～40 °，步長0.028，接受狹縫0.2 mm。通過軟件MDI Jade 5.0分析譜圖，計算結晶度。

1.2.10 差氏掃描量熱分析（DSC） 測定方法參考文獻報道，略有修改[13]。淀粉與蒸餾水以質量比1:2的比例混合均勻后，取樣5 mg于鋁坩堝中，壓片后置于4 ℃冰箱中平衡12 h，以空皿為參比，以5 ℃/min的速率升溫，從25 ℃加熱至100 ℃，記錄T0（起始溫度）、Tp（峰值溫度）、Tc（終止溫度）及焓值（ΔH）的變化情況。

1.2.11 熱重分析（TGA） 測定方法參考文獻報道，略有修改[16]。將淀粉顆粒（約5 mg）放入TGA專用的氧化鋁坩堝中，采用熱重分析儀對樣品進行測定。設置氮氣流量為20 mL/min，溫度范圍為30～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3 數據處理

實驗重復三次，結果取平均值。采用Origin8.6進行原始數據處理和制圖。使用軟件SPSS 21.0進行顯著性分析，以標準偏差表征數據誤差，P＜0.05代表差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 電場處理對α-淀粉酶水解玉米淀粉的影響

2.1.1 電場強度的影響 圖1a為電場處理過程中電場強度對還原糖含量的影響。當電場強度為0時，反應液中還原糖含量為1.60 g/mL。隨著電場強度的增加，淀粉水解產生的還原糖含量逐漸增加。當電場強度為15 V/cm時，淀粉水解后產生的還原糖達到最大值2.79 g/mL，比電場強度為0時提高了74.37%。電場可驅動帶電粒子定向遷移產生電流，該電流通過液體樣品時會產生焦耳熱。高溫條件下，淀粉發生糊化，與酶分子間的親和力大大增加。根據焦耳定律，焦耳熱效應的強度與電場強度平方成正比[17]。由圖2a可知，隨著電場強度的增加，升溫速率逐漸加快，淀粉顆粒被破壞的速率加快，從而淀粉酶解速率增加。但值得注意的是，隨著電場強度從10 V/cm增加到15 V/cm時，還原糖含量增加不顯著(P＞0.05)。這可能是由于電場強度超過10 V/cm后，電場處理產生的溫度超過了淀粉的糊化溫度，完全破壞了淀粉的顆粒結構。除了熱效應外，電場亦可誘導蛋白分子極化，改變酶的構象和活性。低強度電場作用下，酶分子發生輕微極化，活性基團外露，與淀粉間的親和力增加；高強度電場則導致酶分子的強烈極化，破壞維持酶構象的次級鍵，導致酶活性的部分或全部喪失[18]。但值得注意的是，當電場強度超過5 V/cm后，淀粉顆粒被完全破壞，不適合用于制備多孔淀粉；且電極表面可能發生電化學反應導致電極片發黑。綜上，下面的實驗中采用5 V/cm的電場強度進行進一步研究。

圖1 電場處理對還原糖含量的影響Fig.1 Effect of electric field treatment on reducing sugar content

圖2 電場處理過程中反應體系的溫度變化曲線Fig.2 Changes in temperature profiles of reaction mixtures during electric field treatment

2.1.2 電場頻率的影響 圖1b為電場處理過程中頻率對還原糖含量的影響。由圖可知，隨著頻率的不斷升高，還原糖含量先增加后減少，當電場頻率為200 Hz時，還原糖含量達到最大值。但由于國內交流電的常用頻率為50 Hz，故本實驗采取50 Hz的電場頻率進行下一步實驗。電場的頻率會改變酶分子的運動規律，進而影響酶分子攻擊淀粉鏈的速率。SAMARANAYAKE等[9]研究1 Hz～100 MHz電場對α-淀粉酶活力的影響時發現，在1～60 Hz范圍內，淀粉酶活力逐漸增加，最高相對酶活力達141%；但隨著電場頻率進一步的增加，淀粉酶活力略有下降或不變。他們通過分子動力學模擬手段研究α-淀粉酶在不同頻率電場作用下的運動規律，認為淀粉酶活力的變化與其平移/旋轉運動模式及運動位移有關。果膠甲酯化酶的研究結果與α-淀粉酶一致[19]。但本實驗發現電場頻率200 Hz時，還原糖含量最高。這可能是由于SAMARANAYAKE等研究中采用的電場強度為1 V/cm，忽略了熱效應的影響，而在本研究中，電場強度選擇的是5 V/cm，存在明顯的熱效應。圖2b為不同頻率電場作用下，反應體系的溫度變化曲線。

2.1.3 緩沖液濃度的影響 圖1c為電場處理過程中緩沖液濃度對還原糖含量的影響。由圖可知，當緩沖液濃度從0.02 mol/L增加到0.1 mol/L時，還原糖含量顯著增加(P＜0.05)；但隨著緩沖液濃度的進一步增加，還原糖含量變化不顯著(P＞0.05)。根據焦耳定律，焦耳熱效應強度與反應介質的電導率值成正比[17]。隨著緩沖液濃度從0.02 mol/L增加到0.1 mol/L，電導率從4.24 mS/cm增加到15.31 mS/cm（表1）。電場處理過程中，加熱速率從0.13 ℃/min增加到0.61 ℃/min（圖2c）。隨著加熱速率的增加，淀粉顆粒被破壞的速率加快，α-淀粉酶對其親和力增加，淀粉水解速率加快。但當緩沖液濃度從0.1 mol/L增加到0.2 mol/L，電導率從15.31 mS/cm增加到18.27 mS/cm，未發生數量級上的變化，加熱速率變化減少，從而還原糖含量變化不顯著(P＞0.05)。故在后續實驗中采用0.1 mol/L的緩沖液濃度。

表1 不同濃度磷酸緩沖液的電導率值Table 1 Electrical conductivity of phosphate buffer with different concentrations

2.1.4 酶液比的影響 圖1d為電場處理過程中酶液比對還原糖含量的影響。當淀粉酶的添加量從1%增加到5%，還原糖含量從1.56 g/mL提高到2.00 g/mL，提高了28%。通常地，隨著酶添加量的增加，淀粉與酶的碰撞幾率增加，酶促反應效率增加。例如，LU等[20]報道隨著脂肪酶添加量從0.05 g增加到0.20 g，淀粉棕櫚酸酯的取代度從0.110增加到0.153。此外，通過監測不同酶添加量時，電場處理過程中反應體系的溫度變化發現，隨著酶添加量的增加，熱效應強度逐漸增加（圖2d）。這是由于在pH6的磷酸緩沖液中，淀粉酶本身也帶電荷，也會導致體系電導率的增加，從而導致體系升溫速率增加。溫度的增加有助于提高酶的活性和反應活化能，從而有助于淀粉酶解的進行。

2.2 電場輔助酶解產物的顆粒結構表征

在實際生產中，通常電場頻率固定為50 Hz （國內）或60 Hz （美國等）；緩沖液濃度增加會引入大量的鹽，后續處理復雜；酶添加量的增加一方面會提高生產成本，另一方面圖1d和圖2d表明隨著酶添加量從2%增加到5%，淀粉酶解效率變化不顯著(P＞0.05)；而電場強度通常被認為是影響電加工效率的最關鍵因素[21]。圖1a也證實隨著電場強度的增加，還原糖含量顯著增加。因此，本論文將主要針對不同強度電場輔助酶解產物的結構和理化性質進行表征。圖3為天然玉米淀粉及經過不同強度電場（0～15 V/cm）輔助酶解后的淀粉的掃描電鏡圖片。天然玉米淀粉顆粒完整，表面光滑，呈橢球形或多邊形（圖3a），與文獻報道一致[22]。當僅添加α-淀粉酶、未利用電場處理時，淀粉顆粒表面出現少許褶皺和孔洞，可作為優良的吸附劑和包埋劑（圖3b）[23-24]。隨著電場強度從1 V/cm增加到2 V/cm，淀粉水解程度增加，孔洞數目和尺寸增加（圖3c～d）。當電場強度為5 V/cm和7.5 V/cm時，淀粉進一步水解，淀粉大顆粒被破壞成小的片段，且小的片段間相互聚集（圖3e～f）。隨著電場強度進一步增加到10 V/cm和15 V/cm，淀粉完全喪失原有顆粒形狀（圖3g～h）。XUE等[25]在利用感應電場對玉米淀粉改性時發現，淀粉經過處理后表面會產生小孔及碎片。AN等[26]在關于歐姆加熱的研究中發現高強度電場處理將會導致淀粉發生更嚴重的糊化。

圖3 天然玉米淀粉及不同強度電場作用下酶解淀粉的掃描電鏡圖像Fig.3 SEM pictures of native corn starch and starches treated by moderate electric field at different intensities in the presence of α-amylase

2.3 電場輔助酶解產物的結晶結構分析

淀粉的X-射線衍射圖譜有三種：A型淀粉在衍射角15、17、18、23 °附近有較強衍射峰；B型淀粉在衍射角18 °出現明顯的衍射峰，在5.6、20、22和24 °附近出現較弱的衍射峰；C型淀粉為含A型和B型結晶混合結構的淀粉[27]。由圖4可以看出，天然玉米淀粉在2θ=15.3、16.9、17.6、23.2 °出現衍射峰，屬于典型的A型淀粉。當電場強度在0～5 V/cm之間時，淀粉的衍射曲線、衍射峰的位置相近，此時淀粉仍保有原有的結晶結構；當電場強度為7.5～15 V/cm時，衍射曲線發生明顯變化，衍射峰消失，說明淀粉的結晶結構被破壞。通過MDI Jade 5.0軟件計算得出淀粉的結晶度分別是9.8%、2.1%、1.9%，呈逐漸降低的規律，與衍射峰逐漸消失的現象相符合。這是因為電場促進了淀粉的酶解，使淀粉分子受破壞的程度逐漸增強，甚至使淀粉分子破裂，導致結晶度降低。LI等[28]通過大米淀粉的X-射線衍射圖譜得出，經過微波處理過的大米，結晶度降低。HAN等[29]也在研究中得出，淀粉在經過過強的脈沖電場處理后，淀粉顆粒破壞，結晶度降低。此現象也與掃描電鏡中觀察到的淀粉形態結果一致（圖3）。

圖4 天然玉米淀粉（CK）及不同強度電場作用下酶解淀粉的X-射線衍射圖Fig.4 XRD patterns of native corn starch (CK) and starches treated by moderate electric field at different intensities in the presence of α-amylase

2.4 電場輔助酶解產物的糊化性質分析

表2 為天然淀粉和不同強度電場輔助淀粉酶解產物的熱特性分析結果。從表2中可以看出，淀粉的To、Tp、Tc及焓變值的趨勢大致為先增高后降低。當電場強度小于7.5 V/cm時，酶解淀粉的糊化溫度和焓值逐漸增加。這是由于淀粉由致密的結晶區和疏松的無定形區交替排列形成，在淀粉酶解過程中，酶分子會優先攻擊疏松的無定型區，導致淀粉相對結晶度的增加。當電場強度為10 V/cm時，To、Tp、Tc值降低。這可能是由于淀粉的顆粒結構已經發生破壞，熱穩定性隨之下降。當電場強度為15 V/cm時，系統升溫速率快，淀粉發生完全糊化和顯著降解，結晶結構已經被完全破壞，導致DSC曲線上無吸熱峰出現。淀粉的水解通常包括兩個階段：第一階段的快速分解是由于淀粉顆粒中無定形部分的水解，第二部分分解速率緩慢，是由于無定形區域和結晶區域同時水解導致的[27]。無定形部分的優先水解導致結晶度的增加，從而提高了糊化溫度和焓值。ABDORREZA等[30]研究發現，酸解西米淀粉的糊化溫度和焓值隨水解程度的增加而增加，但過高的電場強度會破壞淀粉顆粒中的晶體結構，從而導致焓值降低。HAN等[31]研究發現，隨著脈沖電場強度增加，馬鈴薯淀粉熱穩定性逐漸降低。

表2 天然玉米淀粉（CK）和不同強度電場作用下酶解淀粉的熱特性參數Table 2 Thermal parameters of native corn starch (CK) and starches treated by moderate electric field at different intensities in the presence of α-amylase

2.5 電場輔助酶解產物的熱穩定性分析

圖5 為天然玉米淀粉（CK）及電場輔助酶解產物的TGA曲線。如圖所示，淀粉的熱分解主要有三個階段：30～100 ℃為第一階段，此階段的少量失重主要是因為淀粉表面的游離水和內部結合水的蒸發；第二階段是由于淀粉材料的分解引起的；第三階段，淀粉發生碳化。從圖中可以看出，天然淀粉能夠在300 ℃之前保持較高的殘余率，在熱分解進行到最后質量殘余率最低。經過電場酶解過后的淀粉的失重速率都與天然淀粉存在著差異。當電場強度從0增加到5 V/cm時，酶解淀粉的失重曲線仍與天然淀粉的失重曲線相似，說明此時淀粉受電場酶解的影響較小，淀粉分子中的氫鍵破壞較少，淀粉顆粒仍具有一定的晶體結構；當電場強度從7.5 V/cm增加到15 V/cm時，淀粉的熱穩定性逐漸降低，起始分解溫度較低，可以看出此時淀粉分子的結構受到強烈破壞，分子內部網狀結構幾乎消失，抵抗熱分解能力較弱。WU等[32]也發現酶促水解可降低淀粉的熱穩定性。STEPHEN等[33]在利用脈沖電場處理殼聚糖-玉米醇溶蛋白時發現，脈沖電場可改變復合物間的相互作用，從而影響其熱穩定性。TGA與DSC結果一致。

圖5 天然玉米淀粉（CK）及不同強度電場作用下酶解淀粉的熱重分析曲線Fig.5 TGA curves of native corn starch （CK） and starches treated by moderate electric field at different intensities in the presence of α-amylase

3 結論

中強電場可促進α-淀粉酶水解玉米淀粉。在本論文所采用的實驗條件下：電場強度對于催化效率的影響最顯著，隨著電場強度的增加，電場熱效應增強，從而淀粉酶解效率顯著增加；電場頻率對升溫速率以及酶解效率的影響均不顯著；體系電導率增加，電場熱效應增加，淀粉酶解效率增加；緩沖液濃度和淀粉酶添加量的增加均會導致體系電導率的增加。SEM結果表明，隨著電場強度的增加，酶解產物表面孔洞數量和尺寸逐漸增加，直至淀粉顆粒結構完全被破壞。XRD結果表明，電場強度在5 V/cm以下時，淀粉結晶晶型不變，但相對結晶度逐漸下降；當電場強度達7.5 V/cm以上后，淀粉結晶結構被完全破壞。通過DSC和TGA測定則發現，電場強化酶解后，淀粉的熱穩定性下降；且隨著電場強度的增加，下降程度增加。本研究探究了電場處理對淀粉酶解特性的影響，可為電場技術在淀粉深加工領域的應用提供理論依據。