慢性乙型肝炎患者細胞毒T細胞內穿孔素、干擾素及白細胞介素10表達與病毒消除的關系

李 劇

（大連市公共衛生臨床中心，大連市第六人民醫院，遼寧 大連 116031）

臨床上，慢性乙型肝炎的發病機制十分復雜。現階段眾多學者指出，機體在感染乙型肝炎病毒后，不會對肝臟造成直接損傷，而是與B型流感嗜血桿菌介導的免疫損傷存在密切的聯系[1]。乙型肝炎病毒感染引起的細胞免疫反應在消除乙型肝炎病毒中發揮了十分重要的作用。本次研究以對慢性乙型肝炎患者細胞毒T細胞內穿孔素、干擾素（IFN-γ）及白細胞介素10（IL-10）表達與病毒消除的關系進行研究分析為目的，對收治的慢性乙型肝炎患者展開了CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平檢測，并對檢測結果進行統計分析，結果匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究中資料來源于我院收治的獲得臨床確診的慢性乙型肝炎患者，共56例作為研究對象，定義為觀察組，包括男32例，女24例，年齡19～54歲，平均（29.8±9.2）歲，HBeAg陽性者29例，HBeAg陰性者27例。取同期健康體檢者56名作為研究對象，包括男29例，女27例，年齡18～56歲，平均（28.7±11.3）歲。兩組上述指標比較，無統計學意義，P＞0.05，存在可比性。病情符合診斷標準[2]，且自愿參與研究，簽同意書。研究經倫理委員會批準要求。

1.2 方法 檢測所需儀器為我院現有的FACS Calibur流式細胞儀，BD Cytofix／Cytoperm試劑盒、Perfofin FITC（異硫氰酸）、CD8-藻紅蛋白（PE）、IFN-γ-FITC、IL-10-FITC及作同型對照的鼠抗人IgGγ1γ2-FITC/PE單克隆抗體，購自美國BD公司；Lightcycler熒光定量PCR分析儀，購自Roche公司，HBV-DNA核酸擴增熒光定量檢測試劑盒購自深圳匹基生物工程有限公司，結果在500拷貝/mL以下，可認為陰性[3]。采集受試者晨起空腹狀態下的靜脈血液，選用一次性真空管收集，一份經肝素抗凝，以淋巴細胞表面標記檢測，另外一管分離血清，展開HBV-DNA檢測。

1.3 觀察指標 對兩組受試者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達檢測結果進行對比分析。采用熒光定量PCR法對慢性乙型肝炎患者HBV DNA載量進行檢測，對病毒載量與CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達的關系進行分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件處理。計量資料以（）表示，并實施t檢驗；計數資料以[n（%）]表示，并實施χ2檢驗；P＜0.05，差異有統計學意義。

2 結果

觀察組患者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平較對照組發生顯著降低（P＜0.05）；HBeAg陽性患者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平較HBeAg陰性患者發生顯著降低（P＜0.05）；CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10的表達水平與HBV DNA載量呈負相關（P＜0.05）。見表1～表3。

表1 觀察組與對照組受試者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平比較（%，）

表1 觀察組與對照組受試者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平比較（%，）

表2 觀察組HBeAg陽性與陰性患者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平較（%，）

表2 觀察組HBeAg陽性與陰性患者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平較（%，）

表3 觀察組CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平與HBV DNA載量的關系（）

表3 觀察組CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平與HBV DNA載量的關系（）

注：a與DNA陰性組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；b與低拷貝組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

HBV屬于非細胞毒性病毒的一種，感染該類病毒，雖然不會使肝細胞受到直接的損傷，但所發生的炎性反應，是由免疫介導誘發[4]。既往相關領域的研究顯示，在HBV感染發生的初期階段，多克隆、特異性細胞毒T淋巴細胞（CTL）反應也會隨之產生，在感染病變發生的慢性期階段，CTL反應程度相對低下，甚至完全沒有發生反應[5]。CTL發揮免疫效應的途徑相對較多，通過Fas/FasL介導的肝細胞凋亡進行誘導，或利用分泌IFN-γ、TNF的非細胞裂解途徑等[6]。不充分的CTL反應不但會使HBV的慢性期長時間存在，同時還可以促使非特異性T細胞對肝細胞所造成的損害。Perforin被稱為成孔蛋白、細胞溶素、C9相關蛋白，主要通過激活特異性細胞毒T淋巴細胞、成熟NK細胞進行表達，在吞噬細胞、星形細胞、骨髓前體細胞等細胞中也可出現，具有膜穿孔能力，并可以形成巨大穿膜通道，因此獲得成孔蛋白[7]。

病毒在對人體造成感染后，機體內肝臟消除病毒的途徑較多，主要是非溶細胞性、溶細胞性2種，多以非溶細胞性為主，通過各種細胞因子的作用[8]。不同臨床類型的乙型肝炎患者，其特異性細胞免疫應答存在明顯的差異性。有研究證實，慢性乙型肝炎患者中，特異性CTL存在明顯的功能缺陷，產生Perforin、顆粒酶、IFN-γ能力降低，嚴重時會缺失，在重癥乙型肝炎患者體內，Perforin、顆粒酶的表達水平會發生顯著增高，與乙型肝炎病毒載量呈現明顯負相關[9-10]。乙型肝炎誘發的免疫反應多經T細胞介導，輔助性T淋巴細胞分為Th1、Th2 2種主要亞群，其中Th1細胞分泌干擾素γ、白細胞介素2等細胞因子，對細胞免疫產生介導，Th2細胞主要分泌白細胞介素4、白細胞介素10等細胞因子，會對B細胞增生產生刺激，介導體液免疫[11-12]。在HBV感染后，免疫機制包括天然免疫、適應性免疫，其中適應性免疫在慢性乙型感染患者中具有主導作用，特異性CD8＋T淋巴細胞功能、狀態對慢性乙型肝炎的發展、轉歸等可產生顯著作用[13-14]。

HBeAg屬于一種免疫耐受因子，可促使Th2樣細胞因子分泌，使機體對HBeAg的免疫攻擊反應下調，產生對HBV感染的免疫耐受性，無法消除病毒，從而導致HBV感染發生慢性化[15-17]。HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者與HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，其在分子病原學、發病機制、流行病學以及臨床表現等方面均存在顯著差異。HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者，血清HBeAg水平與CD8＋T細胞活性之間存在明顯的正相關[18-20]。

本次研究結果發現，觀察組患者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平較對照組發生顯著降低；HBeAg陽性患者CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平較HBeAg陰性患者發生顯著降低；CD8＋細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10的表達水平與HIV DNA載量呈負相關。這一結果與相關文獻報道結果相似[21]。由此證實，慢性乙型肝炎患者細胞毒T細胞內Perforin、IFN-γ、IL-10表達水平會發生顯著減少，并且與慢性乙型肝炎患者病毒長期存在有關，與病程遷延不愈存在密切聯系，在今后的臨床診斷和治療中，應給予足夠的關注。