脂肪間充質(zhì)干細胞治療犬急性腎損傷模型的效果評估

徐 麟, 姚兵華，林嘉穎, 陳淑儀, 李 暄, 王丙云, 陳志勝, 劉璨穎，陳勝鋒

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528200 ； 2. 華南農(nóng)業(yè)大學，廣東 廣州 510000)

犬急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是臨床常見且死亡率較高的一種綜合征，主要表現(xiàn)為腎功能急劇衰竭、電解質(zhì)失衡，臨床癥狀主要有少尿甚至無尿、精神沉郁、食欲下降，并可能伴隨不同程度嘔吐、腹瀉、氮血癥和膿毒血癥等[1]。目前常規(guī)治療手段如補液、糾正電解質(zhì)平衡、加快代謝物排泄，甚至透析、換腎等，均以緩解癥狀為主[2]。

間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)療法是近年來新興的一種療法，在皮膚、肝、肺、軟骨、脊髓、神經(jīng)等多種組織的損傷修復方面展現(xiàn)良好的效果[3]。

眾多動物試驗顯示，脂肪間充質(zhì)干細胞(AD-MSCs)移植后能夠向損傷的腎臟聚集，促進損傷腎臟結構和功能的恢復。腎組織特殊的結構，MSCs并不能直接通過腎小球濾過膜進入腎小管[4]，但是有相關試驗應用培養(yǎng)近端小管上皮細胞對AD-MSCs進行誘導分化，結果表明它的表面標志CD90、CD49a的表達下調(diào)，證實了它可以分化為腎小管上皮細胞。MSCs對腎損傷的修復作用還存在一定爭議，大量研究表明[5]，MSCs修復損傷組織的途徑有細胞分化[6]以及旁分泌途徑等[7]，研究表明，腹腔灌注AD-MSCs可以下調(diào)血清中炎性因子以及免疫相關的細胞因子的表達水平。本實驗室前期研究也表明，MSCs分泌的外泌體對慶大霉素致?lián)p的腎小管上皮細胞有促增殖[8]及抑凋亡[9]的作用，提示MSCs可通過其分泌的外泌體來促進受損腎小管的修復。為此，本試驗采用慶大霉素制備犬AKI動物模型，再利用犬AD-MSCs進行治療，通過臨床癥狀、血清肌酐、尿素氮、腫瘤壞死因子以及尿常規(guī)和病理切片等指標評估治療效果，為犬AD-MSCs應用于臨床AKI治療提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 硫酸慶大霉素注射液，購自山西芮城科龍獸藥有限公司；氯化鈉注射液，購自江西創(chuàng)欣藥業(yè)集團有限公司；血清肌肝(SCr)、尿素氮(BUN)試劑盒，均購自南京建成科技有限公司; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)和腎損傷分子-1(KIM-1)ELISA試劑盒，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；尿常規(guī)試紙，購自桂林優(yōu)利特公司。

1.2 主要儀器 小型高速冷凍離心機(5418R型)、核酸蛋白測定儀(BioPhotometerPlus型)，均購自Eppendorf公司;生物組織包埋機(KD-BM型)，購自浙江科迪儀器設備有限公司；切片機(RM2016型)，購自德國Leica公司；普通光學顯微鏡，購自日本尼康公司；獸用犬貓尿比重儀，購自山東田園信科光學儀器公司。

1.3 試驗動物 5～6月齡健康中華田園犬6只(體重5～7 kg)。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計 將6只犬隨機分為模型組和治療組，每組3只，皮下注射80 000 IU/(kg·bw·d)硫酸慶大霉素。試驗分為造模(0～6 d)與治療(7～15 d)2個階段，給藥后，每2 d采血，檢測SCr值，以比基線值≥1.5倍為標準判定為造模成功。治療階段：治療組分別在試驗第7、10天和第13天靜脈注射2×106個AD-MSCs，模型組靜脈輸注等量生理鹽水，試驗期共15 d。

1.4.2 ELISA檢測SCr、BUN、TNF-α、NGAL、KIM-1含量 分別在每次注射AD-MSCs的第3天(即試驗第9、12天和第15天)采集血液，3 000 r/min 離心10 min后收集血清，按試劑盒說明書操作。尿常規(guī)檢測：分別于造模前(第0天)、造模后(第7天)以及治療結束時(第15天)收集尿液樣本，進行尿常規(guī)檢測。組織病理學檢查:各組動物在麻醉、采血及安樂死后，取腎臟組織，固定于 10%中性福爾馬林緩沖液，經(jīng)常規(guī)組織脫水、透明、包埋、切片，然后進行蘇木素-伊紅(H.E.)染色，顯微鏡下觀察并記錄病理變化。臨床癥狀：每天觀察犬的精神狀態(tài)、食欲、尿量、是否嘔吐、是否腹瀉等癥狀。

2 結果

2.1 SCr、BUN、TNF-α、NGAL、KIM-1檢測 如表圖1所示，試驗前6天，兩組犬SCr小幅升高，至第6天時SCr值均>基線值1.5倍并開始大幅上升，均在第12天到達峰值，但治療組峰值明顯小于模型組，第15天時，治療組SCr已降至正常水平。兩組犬BUN水平均在前9天緩慢上升，治療組犬在9 d后逐漸下降，而模型組在12 d后大幅上升；TNF-α、NGAL及KIM-1水平在進行AD-MSCs治療后也逐步下降。

圖1 犬SCr、BUN、TNF-α、NGAL、KIM-1 檢測結果Fig.1 Test results of canine serum SCr,BUN,TNF-α,NGAL and KIM-1A:SCr 水平； B:BUN 水平； C:TNF-α水平； D:NGAL 水平； E:KIM-1 水平A:SCr level; B:BUN level； C:TNF-α level; D：NGAL level; E：KIM-1 level

2.2 臨床癥狀 造模階段：造模前，所有犬只精神狀態(tài)及食欲均良好，尿量正常，無嘔吐、腹瀉等癥狀；第1～2天出現(xiàn)尿頻及尿量增多，第3～5天尿量減少，精神沉郁，食欲減退。治療階段：第7～8天，模型組部分犬食欲完全廢絕，飲水量增加，尿量較少，偶有嘔吐癥狀；而治療組犬恢復部分食欲，尿量增多；第10～11天，模型組犬開始少量進食，但尿量少，精神沉郁；第12～15天，治療組犬的臨床表現(xiàn)基本恢復正常，而模型組犬仍然進食較少，精神狀態(tài)一般。

2.3 犬尿常規(guī)檢查 造模后，如表1所示，犬尿常規(guī)多項指標出現(xiàn)異常，部分犬出現(xiàn)尿潛血及蛋白尿、尿pH及比重下降等。經(jīng)AD-MSCs治療后，治療組犬大部分指標恢復正常。

表1 尿常規(guī)檢查結果Table 1 Results of routine urine tests

2.4 犬腎臟切片 如圖2所示，模型組犬腎臟中腎小管阻塞較多(圖2A)，腎小管上皮細胞廣泛變性、壞死，甚至脫落充滿管腔(圖2B)；而治療組腎小管結構較完整，阻塞較少(圖2C)，腎小管上皮細胞變性較少，管腔中異物較少(圖2D)。

圖2 犬腎臟切片結果(H.E.染色； A、C:100×; B、D:400×)Fig.2 Results of canine kidney slices(H.E. staining; A,C:100×; B,D:400×)

3 討論

制作AKI動物模型的方法主要有：甘油、缺血再灌注[10]、腎毒性藥物(如慶大霉素)、膿毒癥模擬感染順鉑等[11]，其中慶大霉素誘導的AKI模型常用于研究腎小管上皮細胞損傷的相關機制，但造模時間相對較長，用藥劑量需要多次預試驗進行把控，造模程度也較難把握。本試驗采用每天皮下注射80 000 IU/(kg·bw)慶大霉素的方式，可在6 d后成功制備犬AKI模型。

SCr、BUN是臨床上診斷AKI最常用的指標[12]。SCr是肌肉代謝的產(chǎn)物，正常情況下SCr經(jīng)腎小球濾過進入腎小管后，很少被腎小管上皮細胞重吸收。當腎臟出現(xiàn)損傷時，SCr可從受損腎小管上皮細胞進入血液，導致SCr上升。在制作AKI模型時，SCr的數(shù)值≥正常值的1.5倍是判定AKI造模成功的通用標準[13]。BUN是蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物，通過尿素形成與排泄之間的平衡來維持正常的生理濃度，腎血流量減少時，尿素在體內(nèi)滯留增大，使BUN水平上升。因此，檢測BUN能在一定程度上反映腎血流量以及腎小球的濾過功能。經(jīng)過AD-MSCs治療后，SCr及BUN水平均下降，其中BUN甚至可恢復至正常水平，結合尿常規(guī)檢測結果提示，AD-MSCs可一定程度上改善受損的腎功能。

NGAL和KIM-1均是脂環(huán)蛋白家族的一員，在腎小管上皮細胞受損時表達升高，可作為腎損傷早期的生物標記物[14]。本試驗結果顯示，治療組血清NGAL和KIM-1水平在第12天開始下降并在第15天恢復至基線水平，而模型組則處于較高水平。TNF-α是一種炎性因子，其水平與腎小管壞死程度密切相關[15]，造模期間TNF-α水平持續(xù)上升，而經(jīng)AD-MSCs治療后，治療組TNF-α水平在第12～15天呈下降趨勢。綜合這3個指標的變化規(guī)律，說明經(jīng)過AD-MSCs的治療，AKI犬的腎損傷程度得到了一定的修復。

通過病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，模型組腎小管上皮組織發(fā)生廣泛性的變性壞死，小管內(nèi)細胞組織崩解，輪廓模糊不清，血流量的減少也可能導致腎小管壞死，紅細胞破裂，近曲小管腔內(nèi)有許多雜質(zhì)和壞死物填充，阻礙腎臟的濾過作用，大量有毒物質(zhì)積聚在體內(nèi)，遠曲小管結構的破壞，導致腎臟重吸收作用受阻礙。而治療組腎小管、腎小球、腎間質(zhì)之間結構清晰可辨，且管腔內(nèi)異物較少，腎血流量充盈。綜上，經(jīng)AD-MSCs的治療，受損的腎組織結構可在一定程度上得到修復，腎臟的功能也隨之得到改善，從而使SCr、BUN、TNF-α、NGAL、KIM-1等血清指標以及尿常規(guī)等逐漸改善甚至恢復正常。