益生菌防治豬流行性腹瀉研究進展

張淑娟, 牛 錚，闞子斐，張依玲，徐沙沙，鄒 宏，張靜怡，宋振輝，2

(1. 西南大學動物醫學院，重慶 榮昌 402460 ； 2.西南大學醫學研究院免疫學研究中心，重慶 榮昌 402460)

豬流行性腹瀉易感宿主為各個年齡段的豬，癥狀的輕重隨年齡的大小而有所不同，其中以新生仔豬最為嚴重[1]。最近幾年，豬消化道疾病中豬流行性腹瀉發病率、死亡率明顯提高,流行特點和發病癥狀也發生了一定的改變。豬流行性腹瀉病毒傳播途徑主要是直接、間接接觸和氣溶膠傳播[2]。豬感染后，病毒主要是在小腸黏膜上皮細胞中復制。由于病毒增殖首先造成機體小腸上皮細胞正常結構被破壞,繼而出現細胞功能障礙。腸絨毛出現萎縮、脫落、空泡化，造成了腸壁變薄，吸收表面積減少，同時干擾腸道菌群(GM)的平衡，降低益生菌的數量，從而使小腸吸收消化功能降低；另外，腸黏膜上皮細胞內的堿性磷酸酶(ALP)、氨基肽酶(APs)等活性降低或者缺乏，導致腸腔無法將小分子物質進一步分解、吸收，致使營養物質吸收障礙，腸腔內的膠體滲透壓升高，同時，因為ATP酶含量顯著減少，腸上皮細胞內鈉泵機制失活，從而引發仔豬Na+失衡性腹瀉，嚴重時脫水甚至死亡-這是導致病豬死亡的主要原因[3]。豬流行性腹瀉發病日齡低、發病急且死亡率高，患病仔豬不能及時產生主動免疫，所以免疫接種是預防該病的主要手段。2010年以來，Kim等發現全球開始出現豬流行性腹瀉病毒變異體[4]，導致其傳統疫苗在很大程度上失去了保護作用,因此更加迫切需要有效地措施預防該病。在畜牧業中，常將益生菌代替抗生素作為飼料添加劑預防傳染病的發生，其中部分益生菌有較明顯的抗豬流行性腹瀉病毒效果。運用益生菌(如乳酸桿菌、芽孢桿菌等)能夠很有效地減弱豬流行性腹瀉病毒的活性，使有益菌在體內大量定植、快速繁殖,增加腸道內有益菌的數量,從而調整腸道內的微生態平衡,在一定程度上可以預防豬流行性腹瀉。

1 豬流行性腹瀉(PED)的致病機理

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、α-冠狀病毒屬(α-Coronavirus)，是具有包膜的單股正鏈RNA病毒，其結構如圖1所示，組成蛋白主要包括：S蛋白(Spike protein)、E蛋白(Envelope protein)、N蛋白(Nucleocapsid protein)、M蛋白(Membrane protein)和ORF3蛋白等[5]。S蛋白是病毒粒子表面的纖突蛋白，當細胞表面的受體與病毒粒子結合后，S蛋白就會通過膜融合方式侵入到機體細胞并介導宿主產生中和抗體。S蛋白又可以分為S1和S2兩個亞基，豬流行性腹瀉病毒的S1亞基具有高度變異性，負責識別和結合特異性受體，S2亞基與病毒-細胞融合有關且相對保守。S1亞基分為功能域和結構域，結構域又分為N端域(NTD)和C端域(CTD)。NTD和CTD結構域有可能結合不同的受體，特別是碳水化合物或跨膜蛋白。多數蛋白質受體與CTD結構域結合[6]。M蛋白和E蛋白參與形成病毒包膜，N蛋白與病毒基因組一起形成核衣殼。

圖1 豬流行性腹瀉病毒結構

目前研究表明，豬流行性腹瀉病毒入侵細胞的過程為：S糖蛋白與細胞受體結合后，被某種蛋白酶剪切后活化成一種融合肽，再通過融合肽與細胞內成分的融合作用介導該病毒侵入宿主細胞，進而釋放具有感染性的基因組RNA，同時核衣殼蛋白N也被釋放進胞質中[7]。因此，受體是病毒侵入宿主的主要途徑。最初研究表明，氨基肽酶N是血清型I冠狀病毒的主要細胞受體，并且可能是豬流行性腹瀉病毒進入細胞的主要受體，但宋利娜等最新研究證實，豬小腸絨毛腸細胞表達的氨基肽酶N(APN)為α-冠狀病毒的主要受體，但卻不是豬流行性腹瀉病毒所必需的功能受體[8]。目前雖然有用于預防豬流行性腹瀉的相關疫苗(如CV777疫苗株)，但隨著豬流行性腹瀉病毒基因型的不斷變異，其保護效力大幅降低，現在最為迫切的是對該病進行有效的防控。

2 益生菌的功能

益生菌是通過定植在機體內，改變宿主某一部位菌群組成的一類對宿主有益的活性微生物。通過調節宿主黏膜與系統免疫功能或腸道內菌群平衡，從而產生有利于健康作用的單微生物或組成明確的混合微生物，起到促進營養吸收、保持腸道健康的作用。目前文獻報道中常用的益生菌有酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等[9]。

2.1 維持腸道菌群結構平衡 當病原菌入侵時腸道菌群生態平衡就會失調。益生菌在腸道內定植,可大量繁殖成為腸道中有益的正常菌群,以維持腸道內菌群平衡。同時，益生菌可搶占其他病原菌的生存空間和養分或自身分泌殺菌物質等，使得病原菌沒有生存的空間；并且部分益生菌(如雙歧桿菌)中有硝化菌，可阻止動物自身及許多致病菌產生的毒性胺和氨的合成，凈化動物腸道微生態環境；益生菌也可直接作用于腸黏膜免疫系統，促使腸道分泌腸黏液，降低腸黏膜滲透性,以保護腸道黏膜屏障的完整性[10]。

2.2 抑制致病菌的生長和繁殖 益生菌與致病菌競爭定植位點或爭奪營養物質，從而抑制致病菌的生長和繁殖。益生菌可刺激動物免疫器官的生長發育,激活體內具有吞噬作用的T、B淋巴細胞,提高抗體、干擾素和免疫球蛋白水平，增強動物細胞免疫和體液免疫功能，緩解機體的炎癥反應等[10]。例如干酪乳桿菌(LcS)可以調節天然殺傷細胞的活性。鼠李糖乳桿菌(LGG)可以調節先天性和適應性免疫反應，尤其針對胃腸道病原體的免疫反應，從而導致血清IgG和分泌型IgA水平升高[11]。并且，益生菌自身會產生抗菌物質，如戊糖乳桿菌產生的細菌素Pentocin JL-1對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)具有良好的抑制活性[12];乳酸菌、雙歧桿菌、優桿菌等定植到腸道后，會產生大量有機酸(如乙酸)和具有抗菌、增強免疫等作用的活性化合物，對病原菌的定植和生長產生抑制作用[13-14]。

2.3 提高機體抗氧化水平 機體中氧化物(氧自由基和羥基自由基等)，含有未配對的電子，容易發生氧化還原反應，當機體中的氧化物過量時會導致機體產生氧化損傷。機體中存在著抗氧化系統，可以不斷的清除機體合成的氧化物，維持著氧化物的動態平衡。植物乳桿菌C88分泌的多糖通過清除活性氧、上調酶促和非酶促抗氧化劑活性、減少脂質過氧化從而發揮抗氧化作用[15]。植物乳桿菌LPZ菌株能夠提高斷奶仔豬生長性能，降低腹瀉發生率，該菌株能夠提高機體免疫力和抗氧化能力，提升腸道短鏈脂肪酸的含量[16]。

3 益生菌的抗病毒機制

益生菌可通過直接或間接兩種方式來抑制病毒。益生菌與病毒直接相互作用，通過與病毒競爭性結合受體來阻止病毒吸附；間接方式可借助益生菌本身產生的代謝產物等來減弱病毒的致病力,其機制如圖2所示。

圖2 益生菌抗病毒機制A:益生菌與病毒結合； B:益生菌捕獲病毒顆粒； C:益生菌掩蓋細胞特異性受體； D:益生菌競爭性結合細胞受體; E:益生菌代謝產物作用于病毒； F:益生菌刺激腸上皮細胞分泌黏液; G:益生菌干擾病毒周期； H:益生菌調節免疫機制

3.1 益生菌-病毒直接相互作用 益生菌可以直接作用于病毒從而干擾其復制；還可以與病毒結合來阻斷其對宿主細胞受體的附著；另外，益生菌還能捕獲病毒顆粒抑制其進入細胞。例如，從人類陰道分離出的加氏乳桿菌CMUL57就是通過直接相互作用來抑制單純皰疹病毒(HSV-2)的入侵；松果乳桿菌在單純皰疹病毒(HSV-2)的吸附和繁殖過程中未發現明顯的抑制作用，而是在最初感染階段就通過捕獲病毒顆粒來抑制病毒進入細胞[17]。

3.2 益生菌-受體相互作用 益生菌表面的黏附素會先一步黏附在病原微生物的結合靶點上，以此掩蓋特異性或非特異性受體，從而阻止病毒侵入宿主[18]。此外，益生菌還可誘導上皮細胞產生抗病毒物質來抑制病毒繁殖，并與病原體競爭附著在細胞受體上，以防止病毒入侵細胞(如乳酸菌)[17]。豬流行性腹瀉病毒感染宿主的前提是先結合豬小腸上皮細胞上的相應受體靶點，而益生菌產生的黏附物質可能會先黏附在靶細胞受體上，從而阻止豬流行性腹瀉病毒侵入宿主，相關機制有待進一步研究。

3.3 代謝產物-病毒相互作用 益生菌培養過程中產生的代謝產物對病毒有一定的抑制作用，且不會顯著干擾其他微生物菌群。在臨床上，益生菌產生的胞外多糖(EPS)安全無害且具有靶向性，可以刺激IL-12的合成和積累，從而增強自然殺傷細胞的活性和脾臟中IgA的合成。例如，乳酸菌產生的EPS可用于腺病毒的治療[19]。但是，并非所有乳酸菌菌株產生的EPS都能抗病毒，其取決于乳酸菌菌株的生物活性。另外，植物乳桿菌能夠分泌一種雙肽細菌素(Plantaricin EF，Pln EF)誘導腸上皮強化，增強腸道屏障功能，預防豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎等腸道傳染病[20]。

3.4 益生菌-機體相互作用 益生菌通過調節機體的免疫機制，如上調干擾素、白細胞介素等細胞因子水平以及提高血清、糞便中特異性IgA水平，以此增強機體的抗病毒的能力，緩解機體炎癥反應。干擾素(IFN)可以有效防治豬腹瀉，劉延亭等[21]用乳酸菌菌株表達的重組IFN-α等干擾素對豬流行性腹瀉病毒抑制效果最好。植物乳桿菌(Lp-1)通過刺激IPEC-J2或ST細胞內IFN-β介導的JAK1/STAT通路發揮抗傳染性胃腸炎病毒的作用，導致干擾素刺激基因(ISGs)上調，從而誘導抗病毒蛋白如ZAP和PKR的合成[22]。由于豬流行性腹瀉病毒致病機制類似于傳染性胃腸炎病毒，所以具有一定的參考意義。施開創等[23]證明了豬流行性腹瀉病毒 nsp1蛋白抑制IFN-β激活的JAK/STAT信號通路，所以可以通過益生菌激活與IFN相關的信號通路誘導抗病毒反應，促進其產生IFN-α、IFN-β等抗病毒因子，增強抗豬流行性腹瀉病毒活性。在仔豬基礎日糧或飲水中添加植物乳桿菌有良好的抗炎活性，能顯著提高腸道中sIgA的分泌，促進仔豬空腸和回腸絨毛發育，提高絨毛高度、回腸隱窩深度以及腸道黏膜免疫功能[24]，可能減輕豬流行性腹瀉病毒誘導的高水平炎癥反應以及腸絨毛萎縮、脫落、空泡化等癥狀。

4 益生菌抗豬流行性腹瀉機制探討

目前有關益生菌抗豬流行性腹瀉的研究有限，由于傳染性胃腸炎病毒與豬流行性腹瀉病毒同科同屬，臨床癥狀相似，所以常將兩種傳染病一起研究。通過一系列對傳染性胃腸炎病毒的研究推測益生菌可能是從三大方面來發揮抗豬流行性腹瀉病毒的作用。

4.1 益生菌-豬流行性腹瀉病毒 益生菌與豬流行性腹瀉病毒競爭細胞受體或通過吸附病毒顆粒，阻止豬流行性腹瀉病毒的侵入?？莶菅挎邨U菌OKB105和表面活性素能夠與傳染性胃腸炎病毒競爭性結合細胞受體[25]；同時有研究表明，出生到斷奶初期仔豬口服腸球菌可明顯降低仔豬腹瀉率和腹瀉程度，并提高仔豬平均日增重。由于傳染性胃腸炎病毒與豬流行性腹瀉病毒是同屬冠狀病毒且致病機制相似，故益生菌可能與豬流行性腹瀉病毒競爭性結合宿主細胞上受體或吸附病毒顆粒，以阻止豬流行性腹瀉病毒的侵入。

4.2 益生菌代謝產物-豬流行性腹瀉病毒 益生菌代謝物質(如有機酸、胞外多糖)可以減弱病毒效力。豬流行性腹瀉病毒在自然環境下的生存能力不強，在高溫、低pH、高濃度胰蛋白酶和氯仿的環境下，病毒滴度會下降[26]。植物乳桿菌LPZ菌株能在腸道上定植，快速生長和產生乳酸，從而形成低pH環境，可能會減弱豬流行性腹瀉病毒毒力。植物乳桿菌ZN-3菌體或pH 7.0發酵上清液,對細胞無毒副作用,均可在一定程度上降低豬流行性腹瀉病毒對宿主細胞的感染活性,可有效用于預防和治療豬流行性腹瀉[27]。研究發現，植物乳桿菌的EPS能夠促進信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)與occludin和ZO-1基因的啟動子結合，促進腸道緊密連接蛋白的表達，從而增強腸道屏障功能[28]。另外，本課題組前期研究發現，植物乳桿菌LP-1產生的EPS可抑制豬流行性腹瀉病毒感染誘發的炎癥反應。同時，在體外細胞試驗發現了EPS可促進腫瘤壞死因子-α(TNF-α)高水平分泌，其是凋亡的啟動因子，誘導豬流行性腹瀉病毒感染后細胞的凋亡。

豬流行性腹瀉病毒 S1亞基NTD和CTD結構域有可能結合不同的受體，特別是碳水化合物或跨膜蛋白[6]，而益生菌本身會產生淀粉酶、蛋白酶、多聚糖酶等碳水化合物分解酶,可降解宿主靶細胞上豬流行性腹瀉病毒相應受體，是否能阻止豬流行性腹瀉病毒入侵還有待進一步研究。

4.3 益生菌-機體 益生菌刺激機體誘發免疫應答反應及抑制炎癥因子的表達。研究提出，植物乳桿菌可緩解由于致病菌侵襲造成的仔豬腸道緊密連接蛋白claudin-1、occludin和ZO-1含量的降低，提高緊密連接蛋白occludin、ZO-1的mRNA表達以及β-防御素2、3(pBD2,pBD3)的含量，抑制促炎性細胞因子IL-6和IL-8等的表達，增強仔豬腸道上皮的防御功能。同時，植物乳桿菌IS-10506能夠通過提高ERK和β-連環蛋白的表達來激活腸道干細胞的分化，抵抗腸道炎癥，維持腸道健康，進而預防豬流行性腹瀉[29]。

5 益生菌在豬流行性腹瀉上的應用

益生菌在臨床上常用作動物飼料添加劑、微生態制劑和疫苗接種的一種新替代方法。并且將益生菌聯合應用也在臨床上取得了顯著效果。豬流行性腹瀉病毒感染引起仔豬營養不良導致腸道菌群(GM)從門到屬甚至物種水平的失衡和移位。如豬流行性腹瀉病毒感染的仔豬中魏氏梭菌(引起腸發炎)數量顯著增加，而有益細菌(例如產生短鏈脂肪酸、丁酸鹽的細菌)減少。另外，豬流行性腹瀉病毒感染還改變了仔豬腸道中的優勢細菌。研究表明，普氏桿菌、擬桿菌和副球菌是產生短鏈脂肪酸的細菌，丁酸梭菌是產生丁酸鹽的細菌[30]。因此，這些細菌比例的降低可能導致腸道微生物群不穩定，并可能促進豬流行性腹瀉病毒的感染，這說明了腸道菌群(GM)的改變會促進豬流行性腹瀉病毒的感染。因此，腸道菌群在抵抗病毒感染引起的胃腸道傳染病方面起著重要的作用。目前，不同植物乳桿菌菌株已經大量應用于抗病毒研究中。口服滅活的乳酸桿菌L-137(HK-LP)，可激活先天性免疫并增強其誘導的I型干擾素(IFN-β)表達水平，從而提高其抗禽流感病毒H1N1的能力；植物乳桿菌LRCC5310產生的EPS通過抑制TNF-α的分泌和活性來抵抗輪狀病毒。

5.1 地衣芽孢桿菌 Peng等發現，地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑，具有明顯的抗豬流行性腹瀉的作用，地衣芽孢桿菌粗提物(BLFP)中的表面活性素樣肽具有抗豬流行性腹瀉病毒的作用。與對照組相比，試驗組豬流行性腹瀉癥狀有所減輕，細胞外病毒RNA水平顯著降低，腸絨毛脫落和病毒數量也有所減少，并且確定了BLFP在一定劑量下對常規豬是安全且無毒副作用的[31]。

5.2 活乳酸菌 泰國使用乳酸菌上清液(LAB-CFS)預處理Vero細胞，針對豬流行性腹瀉病毒大流行株進行抗病毒活性試驗。Wandee等發現，將乳酸菌的CFS稀釋度控制在1∶16的情況下，不僅可以降低細胞病變效應(CPE)，還對Vero細胞沒有細胞毒性，能夠明顯降低豬流行性腹瀉病毒活性。但LAB-CFS抗豬流行性腹瀉病毒的作用機制尚不清楚，還有待進一步研究。猜測可能是LAB-CFS中代謝物阻止豬流行性腹瀉病毒吸附侵入細胞[32]。

5.3 腸膜明串珠菌 Chang-Liao等從開菲爾谷物中分離出4種乳酸菌(LAB)，即杜蘭腸球菌、腸膜明串珠菌、牛乳桿菌、乳酸乳球菌，其中腸膜明串珠菌的細胞內提取物Ln在感染豬流行性腹瀉的Vero細胞中對豬流行性腹瀉病毒的預防作用更強，并且還具有對豬流行性腹瀉病毒的體外治療作用和體外直接抑制作用。腸膜明串珠菌不是簡單地通過益生菌與病毒的直接相互作用抑制病毒吸附和滲透到細胞中，而是通過顯著上調Vero細胞中黏液病毒抗性蛋白1(MX1)和干擾素刺激基因15 kDa蛋白(ISG15)表達，從而達到抗病毒作用[33]。但其是否還通過其他機制產生抗病毒作用目前尚不明確。

5.4 植物乳桿菌 Huang等發現，植物乳桿菌NC8更適合用作表達保護性抗原的黏膜遞送穿梭載體，所以他們將豬流行性腹瀉病毒的免疫原性S蛋白和誘導的DCpep構建了融合蛋白，并在植物乳桿菌表面表達了該蛋白，獲得純化的重組NC8-pSIP409-pgsA’-S-DCpep在小鼠身上可以特異性結合樹突狀細胞靶向肽并觸發細胞和體液免疫反應。重組NC8-pSIP409-pgsA’-S-DCpep可以明顯增強IgG和IgA的分泌，產生針對S蛋白的特異性抗體，其誘導的全身免疫應答具有良好的豬流行性腹瀉病毒中和活性[34]。重組植物乳桿菌可能有助于開發針對豬流行性腹瀉病毒攻擊的新型疫苗。

6 展望

豬流行性腹瀉是豬養殖業中影響嚴重的傳染病之一，給養豬業造成了巨大的經濟損失。豬流行性腹瀉病毒基因型突變，導致傳統意義上的疫苗在很大程度上失去了保護作用，所以如何在基因型變異的基礎上研究出新方法來防治該病，成了人們研究的熱點。研究發現，大部分益生菌不僅可以減少有害菌的定植，還有抗病毒作用，如果能借助現代先進的研究技術，根據益生菌的不同抗病毒機制對益生菌加以廣泛利用，將會帶來不可估量的經濟效益。臨床上需要篩選抗病毒能力強、安全性好、黏附程度高的益生菌來防治豬流行性腹瀉，減少豬養殖業的經濟損失。但是益生菌效果不是很穩定，其次益生菌起作用必需要有相當數量的活菌，才能保證效果。而且益生菌應用還需要精確到菌株，僅通過屬或種鑒定益生菌是不夠的。所以，新型、有效且穩定的新型菌株是需要不斷發現的。目前，多數研究借助益生菌菌株(如植物乳桿菌、酵母菌)作為載體來研究抗豬流行性腹瀉病毒感染，具有很大的研究開發前景。在人體臨床干預研究中發現，特定的益生菌菌株可以縮短病程或降低某些病毒感染的風險；動物臨床上發現，益生菌和(或)其產物與傳統抗病毒藥物的組合物具有協同作用，在預防和治療某些病毒感染方面也有顯著的效果；并且益生菌在一定的稀釋濃度下還可以提高抗病毒感染性，并且對細胞無毒性。但益生菌抗豬流行性腹瀉的具體機制尚不完全清楚，所以有待進一步研究。相信隨著對益生菌的研究越來越深入，益生菌會為抗豬流行性腹瀉或防治其他動物疫病做出更大的貢獻。