犬源大腸桿菌分離株對β-內酰胺類藥物耐藥性分析及耐藥基因檢測

趙雪洋，王利豪，張婉婷，黃妮妮，王智豪，劉 帥，周變華

(河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471000)

隨著人們生活方式的改變，越來越多的家庭開始飼養寵物犬，主人和犬的親密接觸，加劇了耐藥菌在動物和人類之間的傳播。大腸桿菌在人和動物的腸道中普遍存在，屬于條件性致病菌[1-2]。大腸桿菌經口感染人或動物數小時后就可以進入消化道后段，在體內大量定居、繁殖，通過糞便傳播到環境中[3]，造成細菌在環境中的傳播[4]。動物大腸桿菌病的發病率和死亡率都非常高[5]，防治主要依賴于抗菌藥物的使用[6]，β-內酰胺類抗生素以其殺菌活性強、毒性低、適應癥廣及療效好等優點，被廣泛應用于臨床。伴隨抗生素大量使用，細菌的耐藥情況也逐漸凸顯[6-8]，寵物與人的密切接觸加劇了耐藥菌轉移給人的風險，對公共衛生安全產生極大的危害[9-10]。本試驗開展了犬源大腸桿菌對β-內酰胺類藥物敏感性的分析及耐藥基因的檢測，為獸醫臨床合理用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 2018—2019年間從洛陽市寵物醫院采集寵物犬直腸肛門拭子樣本，采集的樣本接種于麥康凱培養基，37 ℃培養24 h，挑選單個菌落接種于伊紅美藍培養基，再挑取伊紅美藍培養基上單菌落進行生化鑒定和16S rDNA測序分析獲得大腸桿菌樣品40株。質控菌株ATCC 25922，購自中國典型培養物菌種保藏中心。

1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基，藥敏紙片(表1)，均購自杭州微生物試劑有限公司；酵母提取物(Yeast extract)和胰蛋白胨(Tryptone)，均購自英國Oxoid公司；DNA Marker、瓊脂糖、2×TaqMaster Mix，均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。

表1 藥敏紙片Table 1 Drug sensitive paper

1.3 藥敏試驗 以ATCC 25922為質控菌株，依照美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)2014版執行標準，采用紙片擴散法(Kirby-Bauer，K-B)對9種β-內酰胺類藥物進行藥敏試驗。

1.4 耐藥基因的PCR擴增

1.4.1 細菌基因組DNA的制備 取分離菌純培養物1 mL于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，50 μL超純水重懸沉淀，混勻，沸水中煮沸10 min，冷卻后，12 000 r/min離心5 min，上清即為細菌基因組DNA模板。

1.4.2 PCR反應 參照 GenBank 中耐藥基因的序列，設計7 對引物(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系：DNA模板1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 8 μL，總體系為20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、退火溫度15 s、72 ℃延伸2 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

表2 PCR擴增引物和條件Table 2 Primers and conditions for PCR amplification

2 結果

2.1 藥敏試驗 對40株分離的大腸桿菌進行藥敏試驗，結果如表3所示，大腸桿菌對青霉素類藥物氨芐西林、羧芐西林和阿莫西林的耐藥率均大于85.0%，其中對氨芐西林的耐藥率達到100%；對頭孢菌素類藥物的耐藥率相對較低，對頭孢噻肟和頭孢吡肟的耐藥率為32.5%，對頭孢克肟和頭孢曲松的耐藥率為37.5%，對頭孢他啶和頭孢西丁的耐藥率為15.0%。

表3 大腸桿菌對β-內酰胺類藥物的敏感性分析Table 3 β-lactams drug sensitivity analysis in Escherichia coli

2.2 多重耐藥性分析 如圖1所示，在分離菌株中，全部對至少1種藥物耐藥，95%的菌株表現出對3種或3種以上抗菌藥物同時產生耐藥性。有15株菌為3耐，9株菌為4耐，4株菌為5耐，3株菌為6耐，5株菌為7耐，2株菌為9耐。

圖1 大腸桿菌的多重耐藥性分析Fig.1 Analysis of multiple drug resistance in Escherichia coli

2.3 耐藥基因的檢測分析 采用PCR擴增技術對分離菌株進行了β-內酰胺類7種耐藥基因的檢測。其中有14株含有blaDHA，有10株含有blaSHV，有22株含有blaOXA，有22株含有blaCTX-M，40株均含有blaCMY、blaPSE和blaTEM(圖2A)。大腸桿菌分離株同時含有不同種類耐藥基因的現象嚴重，有10株含有3種耐藥基因，有6株含有4種耐藥基因，有12株含有5種耐藥基因，有8株含有6種耐藥基因，有4株含有7種耐藥基因(圖2B)。

圖2 耐藥基因的檢測分析Fig.2 Analysis of drug resistance genesA：β-內酰胺類耐藥基因型分布情況； B：大腸桿菌含3種以上耐藥基因檢出情況A：Distribution of β-lactam drugs resistant genotypes； B：Detection of more than three resistance genes in Escherichia coli

3 討論

大腸桿菌血清型復雜，難以免疫防治，藥物防治仍是控制的主要手段，主要包括青霉素類和頭孢菌素類的β-內酰胺類廣譜半合成抗生素，以其廣譜、高效、低毒等優點，被廣泛應用于臨床。本試驗中，大腸桿菌菌株對β-內酰胺類藥物的耐藥性高，尤其是對青霉素類藥物的耐藥性較高，其中氨芐西林、羧芐西林和阿莫西林的耐藥率分別為100%、85%和 90%，這可能是因為青霉素類藥物作為臨床上較為早期使用的抗菌藥物，隨著藥物的長期應用促進了耐藥菌株的產生，加之藥物的不合理使用，導致耐藥菌株擴散蔓延，這與之前的報道相一致[11]。

大腸桿菌對β-內酰胺類抗生素產生耐藥性的重要機制為質粒介導的AmpC β-內酰胺酶和超廣譜β-內酰胺酶的產生，進而水解藥物的β-內酰胺環，使酰胺鍵斷裂而失去抗菌活性[12]。根據Bush-Jacoby-Medeiros分類方法，可以將β-內酰胺酶可以分為A、B、C和D四類。本試驗發現，犬源大腸桿菌分離株同時對3種以上β-內酰胺類藥物耐藥的菌株高達95%，出現多藥耐藥。進一步對7種β-內酰胺酶的編碼基因進行分析，結果表明，洛陽市寵物犬源大腸桿菌介導耐藥基因主要以blaCMY,blaPSE和blaTEM為主。

綜上，洛陽市寵物犬源大腸桿菌對β-內酰胺類抗生素耐藥性較高，且具有明顯的多藥耐藥現象。因此，嚴格執行《獸藥管理條例》等法律法規，合理使用抗菌藥物，對有效控制和減少耐藥性的產生，降低耐藥菌株傳遞給人類的風險，維護公共衛生的安全具有重要意義。