蛋雞水線綠膿桿菌的分離鑒定、藥敏試驗和致病性試驗

周業飛，張琰杰，柳依靈

(南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 210017)

目前，密閉式乳頭飲水器在我國蛋雞養殖中被廣泛使用，可以有效封閉水源，避免浪費水，提高雞只飲用水品質[1]。有助于保持雞舍干燥、減少發酵和氨氣的釋放，在蛋雞養殖收益中發揮著重要作用[2]。但長期使用后，飲水管道壁和飲水乳頭與管道間隙特別容易滋生細菌，空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、假單胞菌和沙門菌等蛋雞飲用水中常見微生物可通過水線(飲水管道)水傳播給蛋雞，從而給蛋雞健康養殖造成潛在風險[3]。因此，乳頭式密閉式飲水系統的水質是蛋雞養殖過程中重要質控點之一，一些病原菌可能通過水傳播給蛋雞，因此水線(飲水管道)水的生物安全衛生控制是養殖企業重點關注的問題。

本試驗對江蘇南京某蛋雞場水線水采樣，并進行細菌分離鑒定、藥敏試驗和致病性試驗，以期為該蛋雞養殖場乃至該地區臨床用藥和水質管理提供參考建議和理論依據。

1 材料與方法

1.1 水線水樣品 用無菌離心管直接采集江蘇南京某規模化蛋雞養殖場乳頭式密閉式飲水系統的水線(飲水管道)水樣品10 mL。

1.2 主要試劑 所用培養基、生化反應管，均購自青島海博生物技術有限公司；PCR試劑，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；微量生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏紙片(直徑6.0 mm)，購自常德比克曼生物有限公司。

1.3 試驗動物 50只21日齡雛雞，購自南京家禽所種禽孵化場。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌的分離純化 無菌蘸取水線樣品接種在NAC瓊脂培養基，37 ℃培養16 h，觀察菌落形態特征，選取典型菌落純培養再接種于普通營養瓊脂、S.S.瓊脂和血平板上，37 ℃培養12～24 h。對純培養的分離株進行革蘭染色并鏡檢，觀察菌落形態。

1.4.2 分離菌株的生化鑒定 根據綠膿桿菌常見生化試驗進行設計和鑒定。

1.4.3 分離菌株的PCR鑒定 根據已報道[4]的綠膿桿菌外毒素A(ETA)基因序列設計引物，ETA1和ETA2的序列分別為：5′-GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC-3′和5′-CGCTGGCCCATTCGCTCCAGCG-CT-3′，擴增該基因上一段369 bp的區域。采用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提的細菌DNA為模板，PCR反應條件：95 ℃ 預變性2 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。 將PCR產物送至南京擎科生物科技股份有限公司測序。

1.4.4 藥敏試驗 利用紙片法進行藥敏試驗，挑取純培養的綠膿桿菌單菌落溶于無菌生理鹽水中，并均勻涂布于普通營養瓊脂平板上，并等距貼上藥敏紙片，置37 ℃溫箱培養18 h，抑菌環直徑判定依據歐盟藥敏試驗標準(EUCAST)。

1.4.5 致病性試驗 挑取純培養的單菌落溶于無菌PBS中制成菌懸液，按傾注平板培養方法進行活菌計數。將50只21日齡雛雞隨機分成2個組，每組25只。根據預試驗結果，對試驗組雛雞采取胸肌注射菌懸液0.2 mL/只(含菌量為3×108CFU/mL)，對照組雛雞接種無菌PBS 0.2 mL/只。

2 結果

2.1 分離菌株的鑒定及形態觀察 從水線水中分離的細菌，在普通營養瓊脂培養基上形成表面光滑濕潤、微隆、邊緣不整齊的黃綠色的菌落(圖1)。在S.S.瓊脂培養基上有紅色單菌落生長(圖2)，挑取紅色菌落接種在血平板上呈β溶血環，經革蘭染色、鏡檢后確定為革蘭陰性桿菌。

圖1 普通營養瓊脂培養基上菌落形態Fig.1 Colony morphology on common nutrient AGAR medium

圖2 S.S.瓊脂培養基上紅色的單菌落Fig.2 Red single colonies on S.S.AGAR medium

2.2 分離菌株的生化鑒定 分離菌株的生化項目鑒定結果見表1，根據《伯杰細菌鑒定手冊》的鑒定標準，初步判定為綠膿桿菌。

表1 分離菌株生化試驗結果Table 1 Biochemical test results of isolated strains

2.3 分離菌株的PCR鑒定 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的目的條帶大小與預期相符(圖3)。同時測序結果在NCBI上經BLAST對比表明：分離的菌株為綠膿桿菌。

圖3 分離菌株PCR鑒定Fig.3 PCR identification of isolated strains1：綠膿桿菌外毒素A(ETA)基因； 2：陰性對照； M：DL-2 000 DNA相對分子質量標準1:ETA gene fragment of isolate; 2:Negative control; M:DL-2 000 DNA marker

2.4 藥敏試驗 由表2可知，綠膿桿菌分離株對頭孢他啶、鹽酸左氧氟沙星、硫酸阿米卡星、青霉素鉀、環丙沙星較為敏感；對頭孢克肟、氟苯尼考、林可霉素、磷霉素鈣、鹽酸多西環素、阿莫西林、單硫卡耐藥性較強。

表2 2株分離株藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity test results of 2 isolated strains

2.5 致病性試驗 人工感染雛雞后，試驗組雛雞表現出精神沉郁、食欲不振、拉稀等明顯的發病臨床癥狀，發病后期出現震顫或轉圈等神經癥狀。雛雞在接種后12 h開始死亡，96 h后全部死亡。對死亡的病雞剖檢可見死雞皮下及胸肌表面附著淡黃色、膠胨樣水腫液，病程稍久的死雞胸肌化膿呈干酪樣。早期死亡雞心包積液，后期死亡雞可見心包炎。肝臟見出血點，脾臟壞死，肺淤血、水腫。從試驗組雛雞的皮下水腫液、肝臟中均可分離到與原代分離菌株形態特征和生化特性相同的菌株。對照組雛雞均存活，且無明顯臨床癥狀，剖檢后無肉眼可見病灶及出血點，細菌回歸試驗結果為陰性，表明該分離菌對雛雞具有高度致病性。

3 討論

飲用水對維持蛋雞免疫功能和體內電解質平衡至關重要，對蛋雞的健康發揮重要和持續的作用[5]。通過改善衛生條件，防止水傳播疾病，是蛋雞健康養殖可持續發展目標的一個關鍵組成部分。目前，在蛋雞飲用水中常被檢出假單胞菌屬、葡萄球菌屬和大腸桿菌屬等微生物群落，也有彎曲桿菌屬和沙門菌屬等人獸共患病病原體被檢出[6-7]。與革蘭陽性菌相比，革蘭陰性菌的檢出率更高，這可能是因為密閉式乳頭飲水系統中更適合革蘭陰性菌形成微生物生物膜[8]。

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)又稱銅綠假單胞菌，屬假單胞菌屬，是一種條件性致病菌，是導致人類條件性感染的三大原因之一，在家禽養殖中也是一種重要的條件性致病菌，在雞群中可迅速傳播，引起較高的死亡率[9-10]。該菌廣泛分布于自然界中，是一種多功能的革蘭陰性菌，對環境的適應能力和抵抗能力較強，可引起多種動物的臟器出現膿腫現象[11]，主要因為該菌可以產生如黏附素、多糖莢膜和內外毒素等多種致病因子，通過阻遏真核細胞蛋白合成等途徑產生有毒物質，并損傷機體的多種組織和器官[12]。有報道稱，也會與雞大腸桿菌、沙門菌和新城疫等病原體混合感染，引起肉雞的較高死亡率，在蛋雞養殖業中也是不容忽視的威脅之一，可導致胚胎發育停止或死亡，也會給剛出殼的雛雞造成局部或全身性疾病[13-14]。近年來，我國蛋雞養殖業也會受到綠膿桿菌感染的影響，其感染以后發病率呈上升趨勢[15]，由于該病在1～5日齡的雛雞中多發，且感染后多出現各種實質器官損傷，死亡率高，嚴重制約蛋雞產業的發展，加上在養殖過程中對于用藥的不科學和不合理，導致綠膿桿菌的耐藥問題也日益加重[16]。為了對該病的防控和用藥等方面有所指導，本試驗從蛋雞水線水中分離出致病性較強的綠膿桿菌，為蛋雞養殖企業水線消毒劑的種類精準選擇提供了可行性理論依據，提醒養殖者重視綠膿桿菌污染造成的潛在危險，保障雞群飲水水質衛生質量，防止水傳播病原菌在蛋雞群中的流行。

抗菌藥物耐藥性在家禽細菌感染中具有重要意義，因為它可以使抗菌藥物的抗菌效果減弱甚至無效，是造成人類菌群或其他細菌耐藥性的一個重要因素[17]。不同地區和不同場所分離的綠膿桿菌也會因為基因型不同或用藥量和種類不同而產生多重耐藥性[18]。有研究報道[19]從雞心包炎中分離的綠膿桿菌對阿奇霉素、慶大霉素﹑左氧氟沙星、新霉素和諾氟沙星等高度敏感，對多西環素、環丙沙星、多黏菌素和丁胺卡那霉素等中度敏感，對阿莫西林和氨芐西林等不敏感。本試驗通過藥敏試驗發現，分離的綠膿桿菌對頭孢克肟、氟苯尼考、林可霉素、磷霉素鈣、鹽酸多西環素、阿莫西林、單硫卡耐藥性較強。對頭孢他啶、鹽酸左氧氟沙星、硫酸阿米卡星、青霉素鉀、環丙沙星較為敏感。由于環丙沙星、慶大霉素、阿米卡星不存在交叉耐藥性[20]，所以可以考慮聯合用藥。根據藥敏試驗進行藥物篩選和選擇合理的藥物，是目前蛋雞養殖精準用藥管理的需求，根據農業農村部2019年發布的194號公告，飼料端“禁抗”，養殖端“減抗、限抗”大勢已定，而且會越來越嚴格。因此，除了對密閉式乳頭飲水系統的水線水及時和定期消毒外，一旦發現水傳播疫情時，應當及時進行臨床檢測和病原學鑒定，合理使用敏感性藥物，交替輪換用藥，忌濫用藥和亂用藥，做好防治工作，將養殖損失降低到最小。