豬塞內卡谷病毒和圓環病毒2型嵌合病毒樣顆粒疫苗的制備與抗體檢測

何至遠，吳冬荀，張賀楠，王 飛，吳珊珊，劉昕澤，肖 進

(1. 中牧實業股份有限公司，北京 豐臺 100070 ； 2. 中國農業大學動物科學技術學院，北京 海淀 100193)

塞內卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)是單股正鏈RNA病毒，是小RNA病毒科塞內卡病毒屬的唯一成員[1]。不同年齡和品種的豬均易感，母豬發病率高，可達70%～90%，但是感染豬的死亡率很低。2014年底以來，SVV在美國、巴西等國家豬群暴發，同時在北美周邊地區也發現SVV所致水皰病[2-3]。我國于2015年首次檢測到SVV感染母豬出現水皰病臨床癥狀，感染仔豬出現急性死亡，之后在我國多個省份陸續檢出SVV，對養豬業的生產和經濟效益具有較大威脅[4]。疫苗免疫接種被認為是防控塞內卡谷病毒流行的有效手段，當前還沒有市售的SVV商品化疫苗。

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是斷乳仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原，自1991年PMWS在北美發現以來，已在世界范圍內流行[5]。由于PCV2經常與多種病原混合感染，典型性臨床癥狀為消瘦、皮膚蒼白、腹瀉、呼吸障礙及輕度黃疸[6]。

桿狀病毒表達系統是真核細胞表達系統，其具有獨特的生物學特性，培養及操作較簡便，因此被廣泛用于生產基因工程產品[7]。病毒樣顆粒(Virus-like particles)是含有某種病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒核酸，不能自主復制，在形態上與真正病毒粒子相同或相似，表現出與天然病毒更相似的構象表位，能夠有效刺激機體產生體液免疫和細胞免疫應答，由于其不含病毒核酸而無法復制，不具有感染性，是較為安全的候選疫苗[8]。隨著分子生物學技術的飛速發展，利用桿狀病毒表達系統研制基因工程亞單位疫苗受到了追捧。

我國首次于2015年從廣東地區暴發圓環疫情豬群中檢測到豬塞內卡谷病毒[9]，在實際生產中，豬塞內卡谷病毒與豬圓環病毒混合感染時有發生。本試驗旨在通過桿狀病毒表達系統表達豬塞內卡谷病毒、圓環病毒2型嵌合病毒樣顆粒，制備相應的嵌合病毒樣顆粒疫苗。該疫苗經濟實用，為國內養殖企業防控兩種疾病提供了一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、毒株、細胞及實驗動物 大腸桿菌E.coliDH5α/ DH10Bac菌種由本實驗室保存；昆蟲細胞系sf9 細胞、質粒pFBDM、塞內卡谷病毒(CH-FJZZ-2017,CGMCC No.12160)，均由本實驗室保存；70～80日齡SPF豬，均購自北京大學實驗動物中心。

1.2 主要儀器和試劑 限制性內切酶、同源重組酶、膠回收試劑盒和分子篩，均購自北京中原生物科技有限公司；質粒快速提取試劑盒，購自北京艾德萊生物有限公司；SVV高免血清、PCV2單克隆抗體，均由本實驗室保存；轉染試劑Cellfectin，購自Invitrogen貿易有限公司；SFM培養基，購自Lonza貿易有限公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；細胞培養板(瓶)，購自美國Costar公司；ISA206佐劑，購自法國賽彼克貿易有限公司；PCV2-dCap-ELISA 檢測試劑盒“銳捷”，購自瑞普生物藥業有限公司。大型冷凍離心機，購自Eppendorf貿易有限公司；大型雙層恒溫搖床，購自武漢匯誠生物科技有限公司。

1.3 豬塞內卡谷病毒和圓環病毒2型嵌合質粒的構建

1.3.1 豬塞內卡谷病毒P1基因克隆 參照已發表的豬塞內卡谷病毒基因序列(GenBank:KY747510.1)設計引物(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以提取豬塞內卡谷病毒總RNA為模板，經MLV-反轉錄酶合成cDNA第1鏈后，以P1、P2為引物，PCR擴增VP0基因；PCR反應體系為50 μL，PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃ 10 min。將PCR產物連接于pFBDM載體，為pFB-VP0質粒；VP1片段，以P3、P4為引物，cDNA為模板擴增，PCR反應體系為50 μL，PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃ 10 min。分別雙酶切(XhoI/NheI)PCR產物和質粒pFB-VP0，用T4連接酶連接后為pFB-VP0/VP1；VP3片段，以P5、P6為引物，以cDNA為模板，PCR反應體系為50 μL，PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃ 10 min。連接于pFBDM載體，為pFB-VP3質粒；最后雙酶切(XhoI/XbaI)pFB-VP0/VP1質粒回收小片段，與酶切pFB-VP3質粒大片段連接，經篩選獲得含有豬塞內卡谷病毒P1基因完整編碼區序列陽性質粒pFB-P1。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.3.2 豬塞內卡谷病毒VP3、圓環病毒2抗原表位嵌合基因克隆 通過基因序列合成方法實現部分VP3序列替換為豬圓環病毒2型ORF2基因C端部分抗原表位序列，將替換后序列連接pFBDM載體上(含GFP報告基因)，篩選和測序后獲得具有替換后序列的陽性質粒pFB-GFP-VP3-PCV2。

1.3.3 豬塞內卡谷病毒和圓環病毒2抗原表位嵌合基因克隆 設計同源序列P7、P8，用PCR方法以pFB-GFP-VP3-PCV2為模板擴增目的片段GFP-VP3-PCV2，PCR反應體系為50 μL，PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s， 30個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃ 10 min。XhoI和NheI雙酶切法線性化pFB-P1載體，同源重組酶連接目的片段和線性化載體，轉化入DH5α感受態細胞，獲得pFB-GFP-P1-PCV2陽性質粒。

1.4 rFB-P1-PCV2重組桿粒構建與提取 將pFB-GFP-P1-PCV2重組質粒轉化入DH10Bac感受態細胞中，37 ℃培養4 h后涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)、四環素(10 μg/mL)、慶大霉素(7 μg/mL)、X-Gal(100 μg/mL)、IPTG(40 μg/mL)的LB藍白斑篩選平板上，經培養后挑取白色菌落進行PCR鑒定，獲得rFB-P1-PCV2重組載體，擴大培養，采用異丙醇沉淀法抽提重組桿粒，立即使用或置于-20 ℃保存備用。

1.5 嵌合重組桿狀病毒的獲得及鑒定 利用脂質體轉染法將rFB-P1-PCV2轉染sf9細胞，放置于28 ℃培養，48～72 h后細胞變圓、變大，內部出現大量顆粒體，能檢測到大量GFP熒光信號，隨即細胞大量死亡；陰性對照組細胞正常生長，說明重組桿狀病毒組裝成功。收獲培養物后于1 500 g離心5～10 min收取上清，即為F1代病毒液；再用F1代病毒液感染空白sf9細胞，待產生細胞病變達到80%以上時，收獲培養物上清，即為F2代病毒液。依照該方法，將重組桿狀病毒傳至F4代，所有收獲的重組桿狀病毒置于-80 ℃保存備用。

將收獲的嵌合重組桿狀病毒F4代毒種接種于懸浮培養的sf9細胞中，接毒72 h后收獲細胞培養上清。利用分子篩純化后采用SDS-PAGE方法檢測純化效果，然后分別用SVV高免血清和PCV2單克隆抗體進行Western Blot檢測。同時，將純化后嵌合重組蛋白經過負染后，在透射電鏡下觀察病毒樣顆粒結構。

1.6 嵌合病毒樣顆粒疫苗的制備和評價 將純化得到的上述嵌合重組病毒樣顆粒與ISA206佐劑按照質量比1∶1混勻后制成疫苗。為了評價該疫苗在豬上的安全性，將70～80日齡SPF級中大豬8頭隨機分為2個組，每組4頭。免疫組每頭肌內注射2 mL疫苗，對照組為PBS對照組。在免疫前后觀察每頭豬只體溫變化，觀察是否有發熱、厭食等現象。為了進一步評價疫苗對豬的免疫效力，分別于免疫后7、21、28 d和35 d進行前腔靜脈采血，分離血清后利用中和試驗測定SVV的中和抗體，利用ELISA方法檢測PCV2特異性IgG抗體。

2 結果

2.1 嵌合重組桿狀病毒的獲得及鑒定 將rFB-P1-PCV2轉染sf9細胞，sf9細胞產生細胞病變后，收獲培養物上清，并以此感染空白sf9細胞。依照該方法，將重組桿狀病毒傳至F4代，并對桿狀病毒進行熒光檢測，如圖1所示，結果證明成功獲得豬塞內卡谷病毒和圓環病毒2型嵌合重組桿狀病毒。

圖1 嵌合重組桿狀病毒熒光檢測(40×)Fig.1 Fluorescence of chimeric recombinant baculovirus (40×)A：對照sf9細胞白光檢測； B：F1代桿狀病毒白光檢測； C：F4代桿狀病毒白光檢測； D：對照sf9細胞熒光檢測； E：F1代桿狀病毒熒光檢測； F：F4代桿狀病毒熒光檢測A:White light of control sf9; B:White light of F1 baculovirus; C:White light of F4 baculovirus; D:Fluorescence of control sf9; E:Fluorescence of F1 baculovirus; F:Fluorescence of F4 baculovirus

2.2 嵌合病毒樣顆粒抗原蛋白的表達 利用分子篩純化桿狀病毒細胞培養上清液，進行SDS-PAGE檢測，結果如圖2A所示，結果表明得到了較純的SVV嵌合病毒樣顆粒抗原蛋白。為了進一步驗證抗原的免疫原性，采用Western Blot檢測抗原蛋白的表達，結果如圖2B～2C所示，分別采用SVV高免血清(圖2B)和PCV2單克隆抗體(圖2C)進行檢測，結果表明，在試驗組目的大小處均可以觀察到抗原蛋白特異性條帶，大小約為70 kDa，而陰性對照無對應條帶。結果表明試驗獲得的嵌合病毒樣顆粒抗原蛋白得到了良好地表達，并且可以被相應的抗體所識別。

圖2 SDS-PAGE和Western Blot檢測嵌合病毒感染細胞后培養上清Fig.2 SDS-PAGE and Western Blot detections of cell supernatant post chimeric recombinant baculovirus infectionA：SDS-PAGE結果(M：蛋白標準分子質量; 1：陰性對照; 2：純化前細胞上清; 3：純化后細胞上清)； B、C：Western Bolt結果(1～2：純化后細胞上清：3：純化前細胞上清)A:SDS-PAGE results(M:Protein marker; 1:Negative control; 2:Cell supernatant of pre-purification; 3:Purified cell supernatant); B,C:Western Bolt results(1-2:Purified cell supernatant; 3:Cell supernatant of pre-purification)

2.3 嵌合病毒樣顆粒電鏡觀察 將嵌合重組蛋白經過負染后，在透射電鏡下觀察結構。SVV病毒顆粒大小為27～30 nm，預估改造后病毒樣顆粒大小為30 nm，結果如圖3所示，證明嵌合重組蛋白成功形成了病毒樣顆粒結構。

圖3 豬塞內卡谷病毒樣顆粒電鏡圖(100 000×)Fig.3 Electron micrograph of chimeric virus like particles (100 000×)A：野生型病毒樣顆粒； B：嵌合病毒樣顆粒A:Wild-type virus like particles; B:Chimeric virus like particles

2.4 嵌合病毒樣顆粒疫苗在豬體內安全性評價 檢測結果見表2，觀察期內免疫豬和對照豬的健康狀況良好，未出現發熱或其他不良反應，表明該疫苗在豬體內的安全性良好。

表2 疫苗免疫后豬只體溫Table 2 Changes of body temperature in pigs post vaccination (℃,n=8)

2.5 嵌合病毒樣顆粒疫苗在豬體內抗體水平檢測 SVV中和抗體檢測結果見表3，該疫苗具有良好的免疫原性，能夠激發機體產生高水平的SVV特異性中和抗體，免疫組中有3頭豬只免疫后7 d效價均達到1∶64以上，并且在免疫后35 d仍然維持較高的抗體水平。PCV2的ELISA檢測結果如圖4所示，相較于對照組，該疫苗能刺激機體產生較高水平的PCV2血清抗體。

表3 疫苗免疫后豬只SVV抗體情況Table 3 Antibody againgt SVV in pigs post vaccination

圖4 ELISA方法檢測PCV2特異性IgG抗體水平Fig.4 Detection of specific IgG antibody against PCV2 by ELISA與對照組相比，*：P<0.05， **：P<0.01， ***：P<0.001Compare to control group， *：P<0.05，**：P<0.01， ***：P<0.001

3 討論

桿狀病毒表達系統安全高效，本試驗所表達嵌合病毒樣顆粒的抗原成分單一、安全性高，空間結構和功能與天然病毒粒子接近，能夠最大程度保留其免疫原性；相較于單價苗或全病毒疫苗，嵌合病毒樣顆粒疫苗可以在抗原成分上減少免疫引起的副反應，同時也可以減少疫苗免疫次數，減少人工成本，盡量避免豬免疫過程中的應激反應。

由于SVV VP3蛋白位于病毒核衣殼表面，其蛋白表面具有眾多優勢抗原表位，因此在本試驗中優選VP3蛋白的部分氨基酸序列作為靶序列。與此同時，利用分子生物學預測軟件優選獲得PCV2 Cap蛋白的B細胞表位，將其用于上述VP3序列的替換，替換完成后經過Pymol軟件分析，替換后序列并不會改變VP3蛋白原有的空間結構，因此，在本試驗中采取這一方法進行嵌合病毒顆粒的構建。另外，本實驗室前期的研究表明，通過桿狀病毒表達系統表達SVV病毒的VP0、VP1和VP3蛋白在自然狀態下為分泌型蛋白，體外培養條件下可以很好地組裝成病毒樣顆粒，這一點在本試驗中也得到了驗證(圖3)。

研究表明，體液免疫在機體早期清除豬塞內卡谷病毒過程中起到重要作用[10]，而本試驗獲得的豬塞內卡谷病毒和豬圓環病毒2型嵌合病毒樣顆粒疫苗安全性好，且具有良好的免疫原性，可以激活體內產生高水平的中和抗體，效價在免疫后7 d均達到1∶64以上(表3)。另外，該疫苗還可以有效激活產生高水平豬圓環病毒2型特異性IgG抗體，其中免疫后21 d開始IgG抗體維持較高水平(圖4)。但在本試驗中只是檢測了針對2種病毒特異性抗體的表達情況，仍然需要進一步進行攻毒保護試驗，從而更好地評價其有效性。另外，在本試驗中，動物樣本量有限，為了更加準確地評估該嵌合病毒樣顆粒疫苗的免疫保護效果，仍然需要擴大免疫動物樣本量和疫苗的免疫次數。當前我國豬塞內卡谷病毒疫情呈現點狀散發狀態，往往和豬圓環病毒病混發，該疫苗的研發為豬塞內卡谷病毒和豬圓環病毒2型的防控提供新的思路。