LPS及RLX對產后KM小鼠炎性細胞因子的影響

張雪婷，趙雯雯，王風華，呂文憬，張 一，陳建國

(華中農業大學動物醫學院，湖北 武漢 430070)

子宮復舊指母體在胎盤娩出后子宮在一定時間內逐漸恢復至未孕狀態的生理過程，包括子宮體積和重量的減少，肌肉收縮，內膜增生以及血管修復等一系列變化[1]。但由于飼養環境不理想易造成感染，誘發子宮內膜炎或盆腔炎[2-3]，分娩次數過多影響子宮收縮力以及母體年齡和精神狀態等原因也常導致子宮復舊不良。子宮復舊不良作為一種常見的產后并發癥會影響產后恢復以及下次妊娠，從而影響母體的繁殖力和生產性能，給養殖者帶來巨大的經濟損失[4-8]。脂多糖(LPS)是導致奶牛子宮內膜炎優勢菌革蘭陰性菌的主要毒性成分[9]，能夠在體外誘導子宮內膜細胞發生炎癥反應[10],也可通過進行子宮灌注誘導小鼠發生急性子宮內膜炎[11]。松弛素(RLX)對生殖系統作用主要是抑制妊娠子宮收縮[12],促進膠原降解[13-15]。孕酮和雌二醇在妊娠及分娩中起到重要作用[16]，主要通過調節凋亡相關基因與因子等方式調控子宮內膜細胞的增殖與分化[17-21]。白介素等細胞因子也參與維持子宮內膜的降解與重構[22]，并反映機體的健康狀態。本試驗旨在通過向子宮灌注LPS和RLX建立2種不同類型的子宮復舊不良模型，比較其與正常子宮復舊的小鼠血清中雌二醇及孕酮的水平以及部分細胞因子的變化，為出現子宮復舊不良的母體產后治療及藥物療效提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LPS(Eshcherichiacoli0128∶B8)，購自Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司；RLX，購自武漢優爾生商貿有限公司；速眠新Ⅱ注射液，購自吉林省敦化市動物藥品有限公司；雌二醇、孕酮、腫瘤壞死因子(TNF-α)及白介素1-β(IL-1β)的酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，均購自NEWA公司。

1.2 主要儀器 多功能酶標儀，PerkinElmer股份有限公司產品。

1.3 實驗動物 8周齡SPF級KM小鼠，雌性與雄性，8周齡，體重(35±10)g，均購自遼寧長生生物技術股份有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 分組及給藥 雄鼠與雌鼠以1∶3的比例進行配種，雌鼠確定妊娠后挑出。將剛分娩結束的雌性KM小鼠隨機分為3個大組，每組根據灌注次數再隨機分為5個小組，分組及給藥劑量見表1。

表1 試驗小鼠分組及給藥劑量Table 1 Grouping and dosage of the experimental mice

LPS組按20 μL/只給予5 mg/mL的LPS溶液；RLX組按2.5 μg/只給予1.25 μg/mL的RLX溶液，24 h內分4次注射，每次注射0.5 mL；PBS組中各小組分為20 μL劑量組和2 mL劑量組，給予PBS緩沖液20 μL(2 mL)/只。按照0、2 d和4 d各灌注1次的規則，隔天進行1次灌注，共灌注5次。

1.4.2 灌注方法 小鼠麻醉處理后，單手提住尾部使其倒立，平口微量進樣器抽取20 μL藥品，將進樣器經陰道伸入宮腔中約0.8 cm，推注灌注液，并倒提小鼠約1 min。

1.4.3 ELISA檢測TNF-α、IL-1β含量 收集子宮組織制備成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min后收集上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.4 ELISA檢測雌二醇、孕酮含量 末次灌注結束后第2天清晨收集各組小鼠血液樣品，3 000 r/min離心5 min，分離血清，采用ELISA法檢測血清中雌二醇、孕酮含量。

1.4.5 組織學檢查 各組小鼠在麻醉、采血及安樂死后，取雙側子宮固定于10%中性甲醛緩沖液中，經組織脫水、透明、包埋、切片并進行H.E.染色，光學顯微鏡觀察并記錄。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，采用t檢驗法比較各組差異，視P<0.05有統計學意義。數據利用Graphpad Prism 5軟件進行作圖。

2 結果

2.1 LPS和RLX對子宮組織的影響 3個組在子宮體寬度及重量上無明顯差異。H.E.染色后鏡檢結果如圖1 所示，與PBS組相比，產后8 d時，LPS組子宮內膜完整度較低，仍有部分內膜上皮細胞未更新，宮腔內容物排出緩慢，同時存在黏膜下出血，子宮腺擴張伴隨分泌物偏多，肌層出現炎性細胞浸潤等情況。與PBS組相比，RLX組子宮體收縮不全導致惡露等宮腔內容物不能及時排出，另有宮腔容積較大，子宮壁較薄等情況出現。

圖1 KM小鼠子宮組織病理學觀察 (H.E.染色，400×)Fig.1 Histopathological observation of uterus in KM mice (H.E.staining,400×)A：PBS組0 d; B：LPS組0 d; C：RLX組0 d; D：PBS組4 d; E：LPS組4 d; F：RLX組4 d; G：PBS組8 d; H:LPS組8 d; I：RLX組8 d

根據宮腔內容物、內膜完整度、子宮腺體分泌等情況進行打分，評定子宮復舊情況，具體評定標準見表2。

表2 子宮復舊標準Table 2 Uterine involution standard

各組子宮復舊早期、中期和末期情況見表3。與PBS組相比,LPS組和RLX組在0 d時子宮腺體分泌物稍多。4 d時LPS組子宮內仍有較多內容物，子宮收縮緩慢，子宮腺分泌物較多；RLX組子宮壁較薄，宮腔容積較PBS組更大；且2個組與PBS組相比子宮內膜更新緩慢，內膜完整度更低。8 d時PBS組已基本恢復至未孕水平，子宮復舊完成；LPS組與之相比各方面均恢復較差，RLX組則在子宮內容物排出、子宮體收縮、子宮腺體分泌等方面恢復較差。總體來說LPS和RLX進行子宮灌注均會引起子宮復舊不全，LPS主要誘發炎癥反應導致內膜上皮更新遲緩，影響動脈血流；RLX主要導致子宮收縮不全，惡露等內容物排出不及時。

表3 各組子宮復舊評分Table 3 Uterine involution score of each group

2.2 子宮組織中TNF-α與IL-1β的檢測與分析 產后不同時間各組KM小鼠子宮組織TNF-α的濃度變化如圖2A所示，0～8 d期間，LPS組TNF-α濃度一直顯著高于PBS組(P<0.05)，RLX組和PBS組無顯著差異(P>0.05)，但RLX組TNF-α濃度隨著產后天數增加呈緩慢上升的趨勢。產后不同時間各組KM小鼠子宮組織IL-1β的濃度變化如圖2B所示，0～8 d期間，RLX組IL-1β濃度一直顯著低于PBS組(P<0.05)，LPS組和PBS組無明顯差異(P>0.05)。RLX組隨時間推移，子宮組織IL-1β濃度略呈下降趨勢，其余2個組略有波動，無明顯變化趨勢。

圖2 各組子宮組織炎性因子濃度Fig.2 Inflammatory cytokines concentration in uterine tissue of each group與PBS組相比， *：P<0.05， **：P<0.01； 下圖同Compare with PBS group, *：P<0.05， **：P<0.01. The same as below

2.3 血清中雌二醇及孕酮的檢測與分析 產后不同時間各組KM小鼠產后血清雌二醇的濃度變化如圖3A所示，0～8 d期間，所有組別雌二醇濃度均呈升高趨勢。其中0～6 d期間，LPS組與PBS組相比雌二醇極顯著升高(P<0.01)，8 d時較PBS組顯著提升(P<0.05)。 0～8 d期間，RLX組雌二醇濃度始終極顯著高于PBS組(P<0.01)。此外，RLX組的升高趨勢較LPS組相比更為明顯。產后不同時間各組KM小鼠產后血清孕酮的濃度變化如圖3B所示；0～8 d 期間，所有組別孕酮含量均呈上升趨勢，產后初期上升較為緩慢，4 d開始孕酮濃度迅速升高且0～4 d期間RLX組孕酮含量顯著高于正常組(P<0.05)，后期無明顯區別(P>0.05)。

圖3 各組血清中雌二醇(E2)及孕酮(PROG)濃度Fig.3 Estradiol and progesterone of serum concentration in each group

3 討論

當前相關研究多利用未孕小鼠進行子宮內膜炎造模，忽視了自然分娩后母體更容易受環境影響誘發子宮內膜炎的情況，同時因生產等造成肌纖維斷裂、肌肉收縮障礙從而導致子宮復舊不全的情況也未得到重視，常單一進行抗生素給藥或抗炎治療[23]。本試驗以產后KM小鼠為對象，通過對子宮灌注LPS和RLX建立子宮內膜炎及子宮松弛2種子宮復舊不良模型[24]，并檢測TNF-α、IL-1β兩種細胞因子以及雌二醇及孕酮的濃度，光鏡觀察子宮組織形態學變化。結果發現，子宮灌注LPS或RLX后均可導致子宮復舊不良，其中LPS組主要表現為子宮內膜上皮更新不全，炎癥導致宮腔內容物排除不及時和子宮腺封閉延遲；RLX組主要表現為子宮收縮減慢，宮腔容積偏大。LPS對TNF-α的分泌具有促進作用，而RLX對IL-1β有明顯的抑制作用。雌二醇與孕酮水平均隨天數增加而上升，與前期查閱的大部分文獻結果一致，即LPS及RLX對雌激素分泌均有促進作用，其中RLX對雌激素分泌的促進作用極為顯著(P<0.01)。目前，雌激素是否對子宮修復有促進作用尚未明確，但確定雌激素與孕酮對子宮內膜的增殖與分泌同時進行調控。許多研究證實，雌激素具有抗炎作用[25-26]，本試驗中，與PBS組相比，經RLX誘導后產后小鼠血清中雌激素水平極顯著提升，其子宮組織中IL-1β含量明顯受到抑制，且抑制效果隨雌激素含量的水平升高而逐漸明顯，證明雌激素能夠抑制子宮組織分泌IL-1β，對子宮組織有一定的抗炎作用。此外，有研究表明，雌激素能夠促進血管內皮生長因子(VEGF)的生長[27]，促進子宮內膜的修復與血管新生。本試驗中僅RLX組在0～4 d期間孕酮水平與PBS組間存在顯著差異(P<0.05)。當孕酮水平較高時子宮收縮受到抑制，膠原被降解，影響惡露排出，有利于細菌繁殖，進一步導致子宮復舊遲緩。由于孕酮與雌激素間存在協同與拮抗作用[28]，結合本試驗結果，提示當出現子宮復舊不良時可考慮采用雌激素療法，不僅能夠增強子宮收縮力，促進血管新生，增加結締組織膠原合成，同時發揮抗炎作用，對由于不同原因導致的子宮復舊遲緩可能均有效，但臨床應用時雌激素的具體濃度仍待驗證，本試驗僅為雌激素治療多種類型子宮復舊不良提供試驗依據。此前有試驗證明，在進行單次子宮灌注LPS時，雌激素對IL-1β的表達有抑制作用[29-31]，本試驗中LPS為隔天多次灌注且IL-1β水平并未出現明顯改變，具體原因尚需進一步分析驗證，考慮到LPS誘導子宮內膜炎常呈短時急性反應，而實際生產中部分子宮內膜炎病例可能持續較長時間，故應考慮進行細胞炎性因子鑒定，或配合其他藥物進行治療。