2株牛源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物特性

高 尚，徐高原，周明光，張華偉，郝根喜，陳 波，顧 強，向文杰

(武漢科前生物股份有限公司，湖北 武漢 430000)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)屬革蘭陰性菌，可通過消化道和呼吸道等傳播方式感染多種畜禽。Pm在世界范圍內多呈急性流行，能夠引起感染動物多種癥狀，包括食欲下降、體重減輕、水腫和腹瀉，最終可能導致患病動物死亡[1]。預防多殺性巴氏桿菌主要采用疫苗手段，但Pm具有多種血清型，且不同血清型均能夠引起不同性質的疾病[2]，交叉保護能力弱，而抗生素的使用又容易產生耐藥菌株，所以該病還未能得到有效控制。

研究數據表明，我國牛群多感染A、B型巴氏桿菌，引起嚴重的纖維素性肺炎及出血性敗血癥[3]。其中，A型巴氏桿菌主要能夠引起犢牛的肺炎，而B型巴氏桿菌主要引起成年牛的出血性敗血癥[3]。本試驗從廣州一養殖場患有呼吸道疾病的病死犢牛中分離出2株莢膜A型多殺性巴氏桿菌，并對其分子生物學特點進行研究，旨在為臨床診治該病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料 廣州一規模化養牛場病死犢牛，剖檢發現肺臟嚴重出血，呼吸道伴有黏液滲出，肝臟出血淤血。采集肺臟及肝臟組織進行病原分離。

1.2 主要試劑 TSA(Tryptic soy agar)和TSB(Tryptic soy broth)培養基，均購自DB Biotech生物科技有限公司；新生牛血清，購自內蒙古金源康生物工程有限公司；藥敏試紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；革蘭染液和瑞士染液，均購自南京建成科技有限公司；引物合成及基因測序由擎科生物技術有限公司完成。

1.3 實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠55只，4～6周齡，體重(18±2)g，購自華中農業大學實驗動物中心。

1.4 細菌分離 無菌挑取病死牛的肺臟及肝臟組織，均勻涂劃在兩組5%新生牛血清的TSA平板中。分別置于有氧及無氧條件下，37 ℃條件下培養24 h，觀察結果。24 h后于無菌條件下挑取平板上的菌落三區劃線接種于5%新生牛血清的TSA平板上，于37 ℃條件下培養24 h，再挑取單個菌落進行革蘭染色和瑞士染色，觀察細菌形態。

1.5 細菌鑒定 采用高溫裂解法提取細菌DNA。以16S rRNA作為鑒定引物，進行PCR擴增，序列為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，預期目的條帶大小為1 475 bp。

切取目的條帶，采用Hingene瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA，將回收純凈的DNA連接至pMD 18-T載體上并轉入至DH10B感受態細胞內，加入1 mL無抗LB搖菌30 min后，吸取100 μL菌液在Amp抗性的LB平板中培養過夜。挑取LB平板上5個不同的單菌落，分別置于5個裝有LB的EP管中進行搖菌培養，6 h后吸取部分菌液進行16S rRNA PCR鑒定，將出現陽性條帶的對應菌液送檢測序。

通過16S rRNA測序結果可知2株分離菌均為多殺性巴氏桿菌，命名為KQ-Pm-A1和KQ-Pm-A2,設計分型引物進一步對菌株進行分型，見表1。

表1 多殺性巴氏桿菌分型引物Table 1 Typing primer of Pasteurella multocida

1.6 16S rRNA進化樹分析 根據測序結果，在NCBI上進行BLAST比對，選取不同國家、不同地區的多殺性巴氏桿菌16S rRNA序列進行系統發育樹分析。采用Clustal W多序列比對處理序列，并用MEGA 7軟件以最大似然法(Maximum likelihod)構建進化樹。

1.7 藥敏試驗 采用瓊脂擴散方法進行藥敏試驗，將新霉素、美洛西林、多西環素等16種常規藥敏紙片置于細菌平板上培養，24 h后量取抑菌圈直徑。藥敏結果判定按照杭州濱和微生物試劑有限公司發布的標準進行。

1.8 生長曲線的繪制 于無菌操作臺內使用接種環挑取純化后的單個菌落混入裝有5 mL 5%新生牛血清的TSB培養液中，另做一組空白對照。37 ℃條件下，1 600 r/min培養18 h，作為種子液。取3瓶裝有無菌100 mL 5%新生牛血清TSB培養液的錐形瓶，將種子液按照1%的量加入至2瓶錐形瓶中，另1瓶作為對照。37 ℃條件下，1 600 r/min 搖瓶培養32 h， 并在第2、4、6、8、10、12、24、32小時取少量菌液測定不同時間段菌液OD600 nm值及梯度檢驗活菌數。每個濃度均做3個重復，取平均值繪制曲線。

1.9 小鼠攻毒試驗 采用半數致死量(LD50)評價2株分離菌的致病性。取50只雄性昆明小鼠，隨機分為10組，每組5只。調整KQ-Pm-A1初始濃度為1.2×109CFU/mL，KQ-Pm-A2初始濃度為1.01×109CFU/mL。每株分離菌均10倍倍比稀釋為10-5～10-9共5個 梯度，每個梯度攻毒一組小鼠，腹腔注射菌液0.2 mL，另取5只小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水作為對照。連續觀察14 d、記錄各組死亡情況，對死亡小鼠立即剖檢，觀察病理變化并對各臟器進行細菌分離、鑒定，根據Reed-Muench累加法計算分離菌株的半數致死量(LD50)。

2 結果

2.1 細菌的分離 兩組平板中均長出散在的菌落，說明分離菌兼性厭氧。經過純化培養后，可見平皿上長出圓潤光滑、半透明、灰白色的菌落。通過革蘭染色和瑞士染色，鏡檢可見菌株為革蘭陰性短小桿菌，菌體呈現兩端濃染的現象，見圖1、2。

圖1 革蘭染色結果(1 000×)Fig.1 The result of Gram staining

圖2 瑞士染色結果(1 000×)Fig.2 The result of Wrightm staining

2.2 細菌的鑒定 對分離得到的2株分離菌進行16S rRNA PCR擴增，發現2株分離菌均在1 475 bp產生與陽性對照一致的條帶，見圖3。同時，進行多殺性巴氏桿菌分型PCR擴增，發現2株分離菌均在1 044 bp處產生與A型陽性對照相同的條帶，證明2株分離株為A型多殺性巴氏桿菌，命名為KQ-Pm-A1及KQ-Pm-A2，見圖4。通過對16S rRNA切膠回收測序發現，KQ-Pm-A1與GenBank上CP033597.1株同源性達99.80%；KQ-Pm-A2與GenBank上CP015573.1株同源性達99.93%。

圖3 16S rRNA PCR擴增結果Fig.3 Amplification of 16S rRNA gene by PCR

圖4 莢膜A型PCR擴增結果Fig.4 Amplification of capsule type A gene by PCR

2.3 16S rRNA進化樹分析 根據16S rRNA的序列，選取GenBank中已發表的國內外多地區多殺性巴氏桿菌16S rRNA序列，利用MEGA 7軟件成功構建出有根，基于單個基因建立的系統進化樹見圖5。可見KQ-Pm-A1與KQ-Pm-A2同屬一個分支，與國內菌株相比，分離株與海南株同源關系較近，與湖南株、湖北株、湘潭株同源關系較遠。同國外菌株相比，2株分離菌與丹麥、德國、日本、美國、埃及、馬來西亞分離株同源性關系較遠。其中，莢膜A型多殺性巴氏桿菌長沙分離株與莢膜A型多殺性巴氏桿菌美國蒙哥馬利分離株被歸屬同一支，英國分離株同埃及分離株同源關系較近、日本分離株與湖南分離株也有較近的同源性，這些結果提示菌株可能存在相近的遺傳進化關系，表明了多殺性巴氏桿菌的全球流行趨勢。

圖5 多殺性巴氏桿菌16S rRNA遺傳進化樹Fig.5 Genetic tree of 16S rRNA gene in Pasteurella multocida?: 本試驗分離菌?: Isolated bacteria in this experiment

2.4 生長曲線繪制 將KQ-Pm-A1與KQ-Pm-A2兩株菌均以1∶100轉接至5%新生牛血清TSB培養液中，定時取出菌液進行OD600 nm值測定及活菌計數，繪制曲線，見圖6。結果顯示，2株分離菌生長趨勢大致相同，約在6 h進入平臺期，12 h后進入衰退期。

圖6 2株多殺性巴氏桿菌生長曲線Fig.6 Growth curve of two strains of Pasteurella multocida

表2 2株多殺性巴氏桿菌的藥敏結果Table 2 Results of drug sensitivity of two strains of Pasteurella multocida

2.6 小鼠攻毒試驗 昆明小鼠腹腔注射不同濃度的KQ-Pm-A1及KQ-Pm-A2后，均表現出被毛逆亂、精神沉郁、食欲廢絕、畏寒等癥狀，而對照組精神狀態表現正常。

2.6.1 病理學觀察 腹腔注射KQ-Pm-A1及KQ-Pm-A2后，高劑量急性死亡小鼠均表現出嚴重的出血癥狀，包括鼻腔、腳部、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟，腹腔粘連，腸黏膜脫落并伴有出血斑，見圖7。中、低劑量慢性死亡小鼠主要出現心臟及肺臟包裹炎癥滲出物，肝臟大面積淤血，脾臟腫大等癥狀，見圖8。低劑量攻毒后14 d未死亡小鼠及對照組小鼠，剖檢未見病理變化。

圖7 急性死亡小鼠病理學觀察Fig.7 Pathological observation of acute dead miceA：腸黏膜脫落、出血; B：腹腔積液; C：腳部出血; D：鼻腔出血; E：各臟器出血A:Intestinal mucosa shedding and bleeding; B:Abdominal effusion; C:Foot bleeding; D:Nasal bleeding; E:Bleeding from various organs

圖8 慢性死亡小鼠病理學觀察Fig.8 Pathological observation of chronic dead miceA：心包炎; B：各臟器充血病變A:Pericarditis; B:Congestive lesions of various organs

2.6.2 臟器細菌分離 剖檢死亡小鼠，取各臟器在無菌操作臺內進行細菌分離。結果顯示，2株多殺性巴氏桿菌攻毒后，死亡小鼠各臟器均能分離出細菌。對各臟器分離出的細菌進行PCR鑒定，發現均為A型多殺性巴氏桿菌，見圖9。

圖9 攻毒小鼠各臟器細菌分離鑒定Fig.9 Isolation and identification of bacteria in various organs of challenged miceA：臟器細菌分離結果； B：分離菌PCR鑒定結果A:Separation results of viscera bacteria; B:PCR identification results of isolated bacteria

2.6.3 LD50的測定 4周齡小鼠腹腔注射不同濃度A型多殺性巴氏桿菌后，總體死亡趨勢隨著攻毒濃度的降低而降低，空白對照組無死亡。累計法計算KQ-Pm-A1的LD50≈2.4×101.16CFU/mL；KQ-Pm-A2的LD50≈2.02×101.84CFU/mL。

3 討論

多殺性巴氏桿菌是引起牛呼吸道綜合征(Bovine respiratory disease complex, BRDC)的主要病原菌，能夠導致牛出現出血性敗血癥。據統計，美國有14.4%的牛在育肥期患有BRDC，而北美每年有14%～24%的牛死于BRDC[4]。國內報道自2006年起，多地養牛場出現牛出血性敗血癥，并分離出莢膜A型多殺性巴氏桿菌，此后陸續在多個省市分離出該血清型病原[5]。由于缺少有效的防疫手段，該病一直流行至今，每年由P.multocida引發的BRDC在全球范圍內引起嚴重的經濟損失。

本試驗從犢牛體內分離出2株莢膜A型多殺性巴氏桿菌，病死牛以犢牛為主，且傳播較快，臨床表現為呼吸困難，這與國外報道一致[6-7]。近年來，越來越多的報道表明，A型多殺性巴氏桿菌正逐漸成為引起BRCD巴氏桿菌中的主要血清型。Dabo等[8]和Christa等[9]的研究顯示，在引起BRCD的巴氏桿菌中，莢膜A型占比分別為80%及92%。

對KQ-Pm-A1及KQ-Pm-A2的16S rRNA進行測序，選取不同國家和地區已發表的序列進行進化樹分析，發現本試驗的分離菌與湖南、湖北等華中地區的分離株親源性較低，與海南分離株親源性較高。同時還發現，一些不同國家的分離株有較高的親源性，這些結果表明，多殺性巴氏桿菌已經呈全球流行態勢。但在曹瑞勇等[13]的研究中，國內各省間的分離株具有較高的親源性，與國外分離株親源性較低，與本試驗結果有差異，可能的原因是選取比對的樣本不同。因此，要加強對各地區牛源多殺性巴氏桿菌的流行病學調查，以期獲得更加全面的樣本。

采用活菌計數法對KQ-Pm-A1和KQ-Pm-A2進行生長曲線的繪制，結果顯示，2株分離菌在相同的培養條件下，生長規律大致相同。0～6 h時2株菌均在生長期，6～12 h在平臺期，隨后進入衰退期。本試驗繪制的生長曲線與一些已有報道存在差異，朱玲[14]的研究顯示，分離株在8 h進入平臺期，16 h進入衰退期；而謝倩茹等[15]的研究顯示，分離株在2 h后進入平臺期，16 h后開始衰退，這些結果的差異可能與培養細菌的環境有關。在Oslan等[16]的研究中發現，高活細胞數在很大程度上受到微量營養素成分和大量營養素供應的影響，其中組氨酸對于生長是必不可少的，而核黃素也對細菌活力有重要影響。

通過腹腔注射的方式攻毒小鼠，發現2株分離菌均能夠引起小鼠死亡。高劑量攻毒小鼠死亡較快，剖檢可見臟器出血、淤血，中、低劑量攻毒小鼠死亡較慢，剖檢發現胸腹腔均有不同程度的炎性反應，結果符合預期。對攻毒死亡小鼠各臟器進行細菌分離，經鑒定與所攻毒株相同，表明小鼠死亡原因是由所攻菌株引起。測定半數致死量發現，KQ-Pm-A1為2.4×101.16CFU/mL，而KQ-Pm-A2為2.02×101.84CFU/mL，在菌株致病力方面，KQ-Pm-A1要強于KQ-Pm-A2。根據Liu等[17]對多殺性巴氏桿菌毒力的判定標準，小于100 CFU/mL為強毒菌株，可知KQ-Pm-A1為強毒菌株，KQ-Pm-A2為中強毒菌株。

綜上所述，通過傳統培養法及分子生物學法分離鑒定的莢膜A型多殺性巴氏桿菌是造成廣東某養殖場犢牛死亡的主要原因。本試驗可為臨床治療該病及牛源多殺性巴氏桿菌的流行病學調查提供理論依據。