河南省犢牛腹瀉畢氏腸微孢子蟲分子生物學鑒定與分析

蘇銀池，閆 磊，趙玉璽，薛永康，閆躍飛，任小麗，張 震

(1.河南省種牛遺傳性測定中心，河南 鄭州 450003 ； 2.河南省奶牛生產性能測定中心，河南 鄭州 450003 ； 3.華中農業大學動物科學技術學院動物醫學院，湖北 武漢 430070)

微孢子蟲是廣泛寄居于脊椎動物和無脊椎動物宿主的一種專性細胞內寄生蟲[1]。在17種人類致病性微孢子蟲中，畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi,E.bieneusi)在人類和其他動物的流行程度最高。E.bieneusi感染小腸上皮細胞，可引起免疫功能正常和低下的人類感染[2]，臨床表現從無癥狀到出現脫水、吸收不良和慢性腹瀉等[3]。在我國，已有報道在人、一些動物和廢水中發現了E.bieneusi的流行[4-5]，引起了人們對于食源性傳播、水傳播人獸共患病的關注。

基于對小亞基核糖體RNA基因內轉錄間隔區(Internal transcribed spacer,ITS)的PCR序列分析，目前已報道了人和動物中的E.bieneusi約500種基因型[6]。關于牛的E.bieneusi基因型已經檢測到至少40種[7]。根據ITS系統發育分析已經確定，所有E.bieneusi基因型至少可分為9個不同的遺傳群，其中1群為人獸共患病群，2～9群為宿主適應群，先前被認為沒有感染人的潛力，但近年來發現2群中的一些基因型(如J、I、BEB4)也可感染人[8]。關于牛源E.bieneusi的調查多以無腹瀉癥狀牛為主，較少涉及腹瀉犢牛，調查E.bieneusi在宿主不同健康狀況的流行情況，對評估其人獸共患潛力具有重要意義。河南省位于我國中部，是奶牛養殖大省，但是關于河南省腹瀉犢牛E.bieneusi流行情況以及基因型的報道較少。本試驗旨在了解河南省腹瀉犢牛E.bieneusi感染以及基因型的分布情況，并評估腹瀉犢牛E.bieneusi的人獸共患潛力。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 選擇河南省豫南、豫北、豫西、豫東、豫中規模化牧場，采集有明顯腹瀉癥狀犢牛(0～6月齡)的糞便樣品。動物排便后立即使用無菌塑料手套收集新鮮糞便。然后，將每頭動物的糞便樣品單獨放于一次性封口袋，帶回實驗室存放于4 ℃冰箱中待檢。2018年5月—2019年4月共采集糞便樣品140份。

1.2 DNA提取與PCR擴增 使用E.Z.N.A.?DNA提取試劑盒，按照說明書提供的步驟提取糞便樣品DNA，樣本DNA保存在-20 ℃冰箱中備用。為檢測E.bieneusi，按照Pirestani等[5]報道的引物序列以及擴增溫度，采用巢式PCR擴增E.bieneusi的ITS基因。每個樣品至少檢測2次，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后，取凝膠回收產物，使用Diamond?柱式PCR產物純化試劑盒，按照說明書純化回收PCR產物，純化后的產物送測序前保存在-20 ℃冰箱中。

1.3 序列分析 將純化的產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，將PCR純化產物進行測序。使用Clustal X 2.0(http://www.clustal.org)將獲得的序列相互比對，并從GenBank數據庫下載參考序列，以鑒定E.bieneusi的基因型。為了更好地呈現E.bieneusi基因型的多樣性，利用Mega 7(http：//www.megasoftware.net/)軟件構建系統發育樹，采用鄰接法(Neighbour-joining)進行系統發育分析。根據Kimura-2參數模型計算ITS基因序列間的進化距離，通過具有1 000個重復的Bootstrap來分析評估可靠性。本試驗中獲得的E.bieneusi基因序列已提交至GenBank，登錄號為MN178153～MN178161。

1.4 統計分析 采用SPSS 22.0統計軟件整理數據，采用卡方檢驗比較不同年齡段的E.bieneusi感染率，P<0.05被認為差異顯著。

2 結果

2.1E.bieneusi總體與斷奶前后犢牛感染情況 在140份腹瀉犢牛糞便中共檢出陽性樣品9份，感染率為6.43%(9/140)。由表1可知，斷奶前犢牛E.bieneusi感染率低于斷奶犢牛，但差異不顯著(χ2= 0.93，P>0.05)，CHC8為斷奶前犢牛的優勢基因型，J為斷奶后犢牛優勢基因型。

表1 河南省腹瀉犢牛E. bieneusi各年齡段檢出情況Table 1 Detection of E. bieneusi in different age groups of diarrhea calves in Henan province

2.2 基因型分布與序列進化分析 由表2可知，不同地區腹瀉犢牛E.bieneusi感染率為0～10.53%。豫南感染率最高，為10.53%，其次是豫北，為8.51%，豫東感染率最低，為0。本試驗共鑒定出5種基因型，分別為J、I、CHC8、BEB4和BEB6，其中J型(n=3)感染率最高，占所有陽性樣品的33.3%(3/9)，僅在豫北地區有檢出，其次是I型(n=2)和CHC8型(n=2)，占所有樣品的22.2%。BEB4型和BEB6型都是在單個樣本中鑒定出的，占陽性樣品的11.1%，未發現混合感染。由圖1系統進化樹可知，本試驗的5種基因型均屬于E.bieneusi2群，未發現新的基因型。

圖1 基于E. bieneusi ITS 基因序列構建的鄰接進化樹Fig.1 Neighbor-joining tree based on E. bieneusi ITS sequences▲：本試驗中鑒定出的基因型▲:Genotypes identified in this test

表2 河南省腹瀉犢牛E. bieneusi各地區檢出情況Table 2 Detection of E. bieneusi in different areas of diarrhea calves in Henan province

3 討論

河南省腹瀉犢牛E.bieneusi平均感染率為6.43%，其優勢基因型為J。感染率低于我國東北地區3～6月齡無腹瀉癥狀斷奶后犢牛的感染率30.1%(40/133)，其優勢基因型為O[9]；低于上海市無腹瀉癥狀斷奶前犢牛感染率26.5%(214/809)，其優勢基因型為I、J、BEB4[10]；低于中國新疆維吾爾族自治區無腹瀉癥狀的犢牛感染率16.5%(85/514)，其優勢基因型為J[11]；低于寧夏0～6月齡腹瀉犢牛的感染率27.2%(190/698)，其優勢基因型為I和J[8]；同樣低于巴西2月齡以下無腹瀉癥狀牛感染率35.2%(19/54)，其優勢基因型為I[12]。不同試驗之間E.bieneusi流行率的差異可能是由多種因素造成的，包括不同的檢測方法、采樣數量、采樣動物的地理區域、采樣動物的年齡、動物的飼養管理條件和季節等。由上述可知基因型J、I是犢牛常見基因型，但不同試驗的基因型存在差異，這可能與采樣動物年齡、動物生理狀態與采樣地理位置有關。

本試驗共鑒定出5種基因型，均屬于2群成員。盡管2群的基因型與1群基因型之間存在差異，但2群某些基因型也具有廣泛的宿主范圍，因此具有一定的人獸共患潛力。在本試驗中基因型J為優勢基因型，與之前對鹿、山羊、鴿子、金絲猴和人類的研究結果一致[13-14]。相對于基因型J，Ma等[15]在河南和山東調查奶牛的優勢基因型為I。基因型J和I，以前被認為是牛特有的，具有宿主特異性。然而，也有J、I基因型感染人類的報道[16]。BEB8基因型已有感染巴西的奶牛[12]以及我國新疆家兔[17]的報道，但尚未有感染人類的報道，但是Li等[18]在果蔬表面檢測到E.bieneusiBEB8基因型的存在，表明果蔬有向人類傳播E.bieneusiBEB8的風險。BEB6基因型是反芻動物常見的基因型，在牛、綿羊、山羊、羊駝和鹿[19-20]等動物中均有檢出，還在我國的獼猴、貓和廢水中也發現了這種基因型的存在[21-23]。BEB4基因型除了可以感染牛之外，還在捷克共和國無腹瀉癥狀的人身上發現了該基因型[24]。此外，J、BEB6基因型和BEB4基因型曾在我國腹瀉兒童體內發現[14,16,25]。

牛感染E.bieneusi具有一定的年齡相關性，本試驗斷奶前犢牛E.bieneusi感染率低于斷奶后犢牛，這與Fiuza等[12]、Hu等[26]試驗結果一致。但差異不顯著(χ2=0.93，P>0.05)，這與上述試驗結果不一致，可能是由于不同的試驗中采樣的地理位置、采樣數量、動物健康狀況差異導致的。

本試驗以河南省腹瀉犢牛為研究對象，報道了河南省腹瀉犢牛E.bieneusi的感染率、E.bieneusi基因型在斷奶前與斷奶后腹瀉犢牛以及地理的分布情況，同時也評估了腹瀉犢牛E.bieneusi人獸共患潛力。本試驗豐富了河南省犢牛腹瀉病原流行病學資料，對河南省犢牛腹瀉防控以及公共衛生具有一定的參考價值。

對于E.bieneusi，目前還沒有開發出特效藥物或疫苗用來治療和防控[27]。因此對于已經確定感染E.bieneusi的犢牛應及時隔離淘汰，并加強對腹瀉犢牛糞便以及病死犢牛的無害化處理，逐步建立和維護無病牛群，以實現河南省奶牛的健康養殖。