漢麻內(nèi)生菌的分離及其抑菌活性研究

吳 瓊 王 雷 曹滌非 李 瑤 孫 堯 孫 鑫 薛佳瑩 黃國(guó)慶

（黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱 150020）

宿主植物種類及外在環(huán)境不同，植物內(nèi)生菌種類和數(shù)量存在很大差異，因而內(nèi)生菌菌種多種多樣[1-2]。從漢麻中可以篩選出具有抑菌活性的內(nèi)生菌，其會(huì)產(chǎn)生抗生素等活性成分，并且為了避免宿主植株死亡，這些抗生素活性成分毒性相對(duì)較低[3]。因此，開(kāi)發(fā)漢麻內(nèi)生菌，尋找新的抗生素，具有廣闊的研究前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)試劑包括牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基，由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；瓊脂粉。

試驗(yàn)設(shè)備包括恒溫培養(yǎng)箱、全自動(dòng)立式高壓滅菌器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集。選擇茂盛、無(wú)病蟲(chóng)害的漢麻植株，采集其新鮮的葉片、根、莖，每株采集3～4片葉片（無(wú)病蟲(chóng)害及斑點(diǎn)）。

1.2.2 樣品預(yù)處理。采集得到的新鮮漢麻葉片用清水漂洗后切成0.3 cm×0.3 cm的組織塊，將根、莖切成0.3 cm長(zhǎng)的組織塊，對(duì)組織塊進(jìn)行表面處理、表面干燥。

1.2.3 樣品表面消毒。對(duì)預(yù)處理得到的樣品進(jìn)行表面消毒，方法如下：0.1%升汞漂洗10～30 s→無(wú)菌水沖洗數(shù)次→75%乙醇漂洗30～60 s→無(wú)菌水沖洗數(shù)次。檢測(cè)表面消毒有效性：本試驗(yàn)需對(duì)檢驗(yàn)材料組織表面消毒是否全面進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置2組對(duì)照試驗(yàn)。第1組：表面消毒完畢后，取最后一次清洗漢麻樣品的無(wú)菌水涂布于平板培養(yǎng)基上，設(shè)置3個(gè)平行。第2組：將消毒后的漢麻樣品置于平板培養(yǎng)基上，與培養(yǎng)基表面接觸幾分鐘后取出，設(shè)置3個(gè)平行。將2組平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱（相同條件）中培養(yǎng)3 d，觀察平板中是否長(zhǎng)菌。無(wú)菌說(shuō)明消毒徹底；有菌則表明消毒不徹底，需要重新進(jìn)行樣品預(yù)處理、表面消毒用于內(nèi)生菌分離純化。

1.2.4 漢麻內(nèi)生菌分離純化。在無(wú)菌操作條件下將組織塊接種到PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行組織培養(yǎng)，每個(gè)平板接種4～5個(gè)組織塊，共接種6個(gè)平板。將平板分成2組分別置于28℃及37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d。觀察到組織塊長(zhǎng)出菌落后，使用接種環(huán)挑取不同的菌落，采用劃線法將菌落接種于平板培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)。反復(fù)接種2～3次后，挑取單菌落的菌絲體在顯微鏡下觀察，如無(wú)雜菌即可確定為純種菌株。得到的純種菌株分類接種于PDA斜面培養(yǎng)基中編號(hào)保藏。

1.2.5 漢麻內(nèi)生菌發(fā)酵液上清液抑菌活性測(cè)定。菌株培養(yǎng)條件：溫度設(shè)置為30℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，用100 mL三角瓶裝液30 mL，培養(yǎng)基的初始pH值設(shè)定為7.2。對(duì)發(fā)酵液上清液的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定采用的是菌絲平板生長(zhǎng)抑制法[4-6]，方法如下：在無(wú)菌條件下操作，吸取2.5 mL菌株發(fā)酵液上清液置于培養(yǎng)皿中，取12.5 mL融化后冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿中，混合均勻制成平板。對(duì)照以無(wú)菌水代替發(fā)酵液上清液。試驗(yàn)組及對(duì)照組均設(shè)3次重復(fù)。將供試病原菌菌絲塊接入平板中央，30℃恒溫培養(yǎng)。觀察到對(duì)照培養(yǎng)皿中病原菌菌絲長(zhǎng)滿平板時(shí)，采用十字交叉法，用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿的病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。計(jì)算方法如下：

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑－樣品菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100

2 結(jié)果與分析

2.1 漢麻不同部位菌株種類

由表1可知，在64株漢麻內(nèi)生菌中，15株來(lái)自漢麻根段、16株來(lái)自漢麻莖段、33株來(lái)自漢麻葉。結(jié)果表明，漢麻葉中的內(nèi)生菌資源較豐富。

表1 漢麻不同部位內(nèi)生菌分布情況

2.2 漢麻內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原菌的抑制率

對(duì)17株漢麻內(nèi)生細(xì)菌（3株來(lái)自漢麻根段、5株來(lái)自漢麻莖段、9株來(lái)自漢麻葉）的發(fā)酵液上清液進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，檢測(cè)到8株有抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制率不同（表2）。由表2可知，漢麻內(nèi)生細(xì)菌中有抑菌活性的菌株比例較高且抑菌譜較廣，對(duì)于供試細(xì)菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等均表現(xiàn)出一定的抑制作用。在8株有抑菌活性的漢麻內(nèi)生細(xì)菌中，有6株來(lái)自漢麻葉片。

表2 漢麻內(nèi)生細(xì)菌對(duì)3種病原菌抑菌效果

3 結(jié)論

結(jié)果表明，從漢麻中分離得到64株內(nèi)生菌，其中15株來(lái)自漢麻根段、16株來(lái)自漢麻莖段、33株來(lái)自漢麻葉，漢麻葉中的內(nèi)生菌資源較豐富。漢麻內(nèi)生細(xì)菌中有抑菌活性的菌株比例較高且抑菌譜較廣，對(duì)于供試細(xì)菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等均表現(xiàn)出一定的抑制作用。