植物乳桿菌MG-1半固態(tài)發(fā)酵豇豆工藝響應(yīng)面優(yōu)化研究

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（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.汝城縣繁華食品有限公司，湖南 郴州424100；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，湖南 長沙410128）

豇豆是中國的大宗蔬菜，含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)及微量元素，具有益氣健脾、開胃和中等功效，被譽(yù)為“蔬菜中的肉類”[1]。其營養(yǎng)價(jià)值高、質(zhì)脆味美，深受大眾喜愛[2-3]。

由于豇豆采收后不易貯藏、易萎蔫、褪色和腐爛，所以新鮮豇豆采摘后要及時(shí)進(jìn)行處理[4]。人們通過不同的加工方法對(duì)豇豆進(jìn)行加工和利用，腌漬發(fā)酵豇豆因耐貯藏、口味獨(dú)特而深受大眾喜歡[5-7]。但在制作過程中方法不當(dāng)也會(huì)引起一些食品安全問題，如食鹽含量過高及亞硝酸鹽含量超標(biāo)等[8-10]。因此，對(duì)其發(fā)酵方法進(jìn)行研究，掌握豇豆發(fā)酵過程的主要工藝參數(shù)及品質(zhì)變化規(guī)律、降低食鹽使用量和亞硝酸鹽含量，提高豇豆食品的安全性和營養(yǎng)價(jià)值具有重要的意義。

以發(fā)酵后豇豆的總酸含量、亞硝酸鹽含量、維C含量進(jìn)行加權(quán)，綜合加權(quán)指標(biāo)X=0.3×總酸含量+0.3×維C含量+0.4×（1/亞硝酸鹽含量），以自然發(fā)酵做對(duì)照，通過響應(yīng)面曲線對(duì)豇豆發(fā)酵加工工藝的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

豇豆，購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東芝源超市，以無損傷、無腐爛或發(fā)霉，新鮮為標(biāo)準(zhǔn)，采收后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)；食鹽，購自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東芝源超市；植物乳桿菌MG-1（Lactobacillus plantarum），湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存，GenBank（MG766279）；氫氧化鈉、乙酸鋅、冰醋酸、鹽酸、亞鐵氰化鉀、草酸、抗壞血酸、2,6-二氯靛酚，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S48型水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；WFJ7200型可見光分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；ZWFR-2112型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器有限公司產(chǎn)品；LRH-250型智能生化培養(yǎng)箱，上海飛躍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

樣品處理所用器具都用0.1%次氯酸鈉進(jìn)行消毒處理。試驗(yàn)原料選擇新鮮脆嫩，無腐爛、無發(fā)霉的豇豆，清洗豇豆表面的泥沙、污物洗凈、晾干；切成2～3 cm的段，且每份樣品稱取100 g，根據(jù)響應(yīng)面曲線設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，按照不同的植物乳桿菌MG-1接種量、食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水分含量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間處理豇豆。發(fā)酵完成后，測(cè)定其總酸含量、亞硝酸鹽含量、維C含量并進(jìn)行綜合加權(quán)。

1.3.2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)

以Box-behnken法為根據(jù)，按照發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、水分含量及食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量，綜合亞硝酸鹽含量、維C含量和總酸含量作為加權(quán)指標(biāo)，設(shè)計(jì)五因素三水平響應(yīng)曲面，優(yōu)化豇豆植物乳桿菌MG-1發(fā)酵工藝，確定最優(yōu)組合。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.3 指標(biāo)的測(cè)定

（1）總酸含量的測(cè)定。按照國標(biāo)GB/T 12408—2008進(jìn)行測(cè)定[11]，樣品中總酸（以乳酸量計(jì)）含量。

（2）亞硝酸鹽含量的測(cè)定方法。按照國標(biāo)GB 5009.33—2016進(jìn)行測(cè)定[12]。

（3）維C含量的測(cè)定。按照GB 5009.86—2016食品中抗壞血酸的測(cè)定方法，采用2,6-二氯靛酚滴定法測(cè)定[13]。

綜合指標(biāo)X=0.3×總酸含量+0.3×維C含量+0.4×（1/亞硝酸鹽含量）。綜合指標(biāo)值越大代表植物乳桿菌MG-1純種半固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵豇豆效果越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

以不同植物乳桿菌MG-1接種量、食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水分含量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間處理豇豆，以亞硝酸鹽含量、總酸含量、維C含量為加權(quán)綜合指標(biāo)，確定了5個(gè)因素對(duì)豇豆發(fā)酵效果的影響。試驗(yàn)共有46組，其中有析因點(diǎn)40個(gè)，6個(gè)零點(diǎn)為中心重復(fù)試驗(yàn)，估計(jì)誤差。

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

采用多元回歸分析處理響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表3所示。非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合后，得到如下回歸模型方程：

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表3。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知，該響應(yīng)面回歸模型具有顯著性（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)的F值不顯著（p＞0.05），表明模型與試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果擬合性較好。方程一次項(xiàng)中，食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（E）因素對(duì)響應(yīng)值（豇豆發(fā)酵指標(biāo)）的影響極顯著（p＜0.01），方程一次項(xiàng)中，發(fā)酵溫度因素對(duì)豇豆發(fā)酵指標(biāo)的影響顯著（p＜0.05）。各因素對(duì)指標(biāo)影響順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間、食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、接種量、發(fā)酵溫度及水分含量。二次項(xiàng)因素均具有顯著性（p＜0.01），表明具有顯著的曲線關(guān)系。

2.3 試驗(yàn)因素相互作用分析

在各試驗(yàn)因素之間，食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)和發(fā)酵時(shí)間、接種量和水分含量、接種量和發(fā)酵時(shí)間、水分含量和發(fā)酵溫度、水分含量和發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)豇豆發(fā)酵效果影響均不明顯（p＞0.05）。但接種量和發(fā)酵溫度之間的相互作用效果明顯（p＜0.05）。

接種量取恒定值時(shí)，響應(yīng)面綜合指標(biāo)隨著發(fā)酵溫度降低先增加后降低，31℃時(shí)獲得最大值；若固定發(fā)酵溫度，響應(yīng)面綜合指標(biāo)隨著接種量的降低先增加后下降，接種量為5%獲得最大值。兩因素相互作用等高線趨于橢圓形（p＜0.05），說明該相互作用對(duì)發(fā)酵結(jié)果有較大影響。而從等高線的疏密程度可以判斷，在該交互作用中，接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響較發(fā)酵溫度要大。

接種量和發(fā)酵溫度對(duì)響應(yīng)面指標(biāo)的影響見圖1。

圖1 接種量和發(fā)酵溫度對(duì)響應(yīng)面指標(biāo)的影響

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)對(duì)豇豆純種發(fā)酵指標(biāo)的二次多項(xiàng)方程求解，得到最佳發(fā)酵組合為發(fā)酵溫度31.09℃，接種量5.10%，食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.59%，水分含量85.56%，發(fā)酵時(shí)間6.6 d，在此條件下得到的加權(quán)綜合發(fā)酵指標(biāo)為0.976 6。因此，結(jié)合實(shí)際情況，確定發(fā)酵條件為接種量5%，溫度31℃，水分含量85%，食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，發(fā)酵時(shí)間7 d，重復(fù)3次試驗(yàn)。

接種發(fā)酵與自然發(fā)酵對(duì)豇豆亞硝酸鹽、總酸、維C含量、硬度、色差的影響見表4。

由表4可知，接種發(fā)酵的亞硝酸鹽含量和色差明顯明顯低于自然發(fā)酵；總酸含量、維C含量和硬度均高于自然發(fā)酵的結(jié)果。因此，植物乳桿菌MG-1純種半固態(tài)發(fā)酵豇豆不僅可以保持豇豆良好的脆度和口感，也減少了豇豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值的流失。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)，以亞硝酸鹽含量、總酸含量、維C含量為加權(quán)綜合指標(biāo)，確定了獲得最佳豇豆發(fā)酵工藝條件。在該條件下制備發(fā)酵豇豆可以獲得較之前更好的效果，為豇豆高值化利用和附加產(chǎn)品提供了新思路。豇豆發(fā)酵加工由自然發(fā)酵逐漸向純種發(fā)酵轉(zhuǎn)變。接種發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌在發(fā)酵過程中起主導(dǎo)菌群的作用[14]。研究的植物乳桿菌MG-1純種半固態(tài)發(fā)酵豇豆。結(jié)果表明，該種發(fā)酵方式不僅可以人為控制自然發(fā)酵的諸多不足，所用菌種快速成為優(yōu)勢(shì)菌，能夠加快發(fā)酵速度、減少營養(yǎng)成分損失、保持脆度、降低亞硝酸鹽含量，而且還可進(jìn)一步運(yùn)用于發(fā)酵蔬菜低鹽工藝中。