男性不育患者Y染色體微缺失、染色體核型及性激素水平分析

張恒 劉穎 徐旻 吳海嘯 楊慶 胡洋

不孕不育是嚴重危害人類生殖健康的世界性問題。目前全球約有10%～15%的育齡夫妻受其困擾，而其中一半是由于男性因素引起的[1]。男性不育主要是外界環境因素和遺傳因素相互作用，進而影響精子發生過程導致的，臨床表現為男性生精障礙，如少精癥、無精癥等。遺傳因素是男性不育的主要原因之一，約占30%[2]。Y染色體微缺失和染色體核型異常是目前已知的兩個重要遺傳學病因[3]。內分泌因素也是男性不育的主要原因之一，在精子發生和雄激素合成過程中，下丘腦-垂體-睪丸內分泌軸發揮重要的調節作用。因此，本文對362例男性不育患者Y染色體微缺失、染色體核型及性激素水平進行檢測與分析，探討其對男性患者不育診斷與治療的價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年1月至2021年1月因不育至金華市中心醫院就診的男性患者362例，排除梗阻性無精癥患者。依據WHO第5版《人類精液檢測與處理實驗手冊》相關標準評估精子質量：無精癥112例，嚴重少精癥151例，精液質量正常99例。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法 采集患者外周血標本3份，分別行Y染色體微缺失檢測、細胞遺傳學分析和性激素水平檢測。

1.2.1 Y染色體微缺失檢測 采用qRT-PCR法。使用DNA提取試劑盒提取200 μl抗凝血的基因組DNA，用NanoDrop 2000微型紫外分光光度儀（美國Thermo Scientific）測定所提取DNA的濃度。使用7500 qRT-PCR儀（美國ABI），根據歐洲男科協會/歐洲分子遺傳質量協作網發表的序列位置標簽對Y染色體無精子因子（azoospermia factor，AZF）a、AZFb、AZFc等3個區域缺失狀態進行檢測。反應體系：PCR混合物 22.75 μl，酶 0.25 μl，DNA 模板 2 μl（樣品 DNA 濃度控制在10～100 g/L）。反應條件：95℃ 3 min；95℃15 s，63 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共 10 個循環；95 ℃ 15 s，63℃ 32 s，72℃ 20 s，共30個循環。發展至第三階段時，確定溫度達到63℃后采集熒光信號。

1.2.2 染色體核型異常檢測 采用細胞遺傳學分析。取患者靜脈血2 ml，加入濃度為500 U/ml的肝素抗凝，將經旋混轉勻后用7號針頭垂直滴25滴于盛有5 ml RPMI1640的培養瓶中，37℃封閉培養72 h，在終止培養前3～4 h加入秋水仙堿（20 mg/L）。將培養的細胞懸液離心，對分離的細胞進行低滲、固定、胰蛋白酶消化及吉姆薩染色處理，G顯帶。每例患者計數30個分裂相，尋找5個染色分散良好、帶紋清晰的分裂相作核型分析，核型異常者加倍計數與分析。結合人類細胞遺傳學國際命名體制確定異常核型的名稱，并深入剖析異常核型。

1.2.3 性激素水平檢測 采用貝克曼DXI 800全自動免疫分析系統及配套的血清試劑盒檢測促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、睪酮（testosterone，T）和催乳素（prolactin，PRL）水平。男性性激素水平正常范圍：FSH 為 1.27～19.26 U/L，LH 為 1.24～8.62 U/L，T 為6.07～27.10 nmol/L，PRL為 55.97～278.36 mU/L。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者Y染色體微缺失情況 362例患者中，Y染色體微缺失有28例（7.7%），包括AZFb位點缺失2例（0.6%）、AZFc位點缺失 21例（5.8%）、AZFbc位點缺失3例（0.8%）、AZFabc位點缺失2例（0.6%）。無精癥組、嚴重少精癥組、精子正常組Y染色體微缺失率分別為 11.6%（13/112）、9.9%（15/151）、0.0%（0/99），差異有統計學意義（P＜0.05）；3組患者Y染色體各位點缺失情況見表1。

表1 3組患者Y染色體各位點缺失情況（例）

2.2 3組患者染色體核型異常情況 無精癥組發現染色體核型異常18例，異常率為16.1%（18/112），包括染色體數目異常11例、染色體結構異常4例、性反轉3例；嚴重少精癥組發現染色體核型異常4例，異常率為2.6%（4/151），包括染色體數目異常2例、染色體結構異常2例；精液正常組未發現存在染色體核型異常，見表2。

表2 3組患者染色體核型異常情況（例）

2.3 3組患者性激素水平比較 3組患者FSH和LH水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中無精癥組、嚴重少精癥組FSH、LH水平均明顯高于精液正常組（均P＜0.05）；3組患者T和PRL水平比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 3組患者性激素水平比較

3 討論

在男性不育患者中，無精癥、嚴重少精癥占了較大的比例，臨床上常見的原因有染色體異常、內分泌因素、外部環境因素、生殖道梗阻、睪丸病變、精索靜脈曲張等。精子的發生是一個相當復雜的過程，減數分裂、有絲分裂均受到不同染色體的影響，當染色體不正常、基因缺失時，易導致精子異常，嚴重降低精子質量，最終影響生育功能。Y染色體微缺失、染色體核型檢測能反映出部分遺傳方面的原因，為男性不育患者的臨床診斷和治療提供新的路徑[4]。

在無精癥患者中，Y染色體的長臂常常缺失，這一現象最初由Tiepolo等[5]在1976年首次發現，經進一步研究后，該學者把位于Y染色體長臂1區1帶（Yq1.1）并參與調控精子生成的區段命名為AZF。隨后，Voget等[6]確定AZF的位置在Y染色體q臂第5、6區，基于此分成3個獨立區域，包括AZFa、AZFb、AZFc。而AZF區域片段的變化、缺少，被稱為Y染色體微缺失；這會影響精子形成，導致無精、少精等情況的發生，最終導致不育。Y染色體微缺失作為男性不育的第二大遺傳因素，其發生率僅次于Klinefelter綜合征。研究表明，無精癥或嚴重少精癥患者發生Y染色體微缺失的概率為2%～11%，某些地區表現出更高的發生率[7]。AZF區段的微缺失是不育的一個主要遺傳原因，因此對男性不育患者開展Y染色體微缺失檢測具有臨床意義。某研究對相關臨床數據進行分析后得出，Y染色體微缺失僅在 AZFa、AZFb、AZFbc、AZFc、AZFabc 等區域有相應表現[8]。此外，一些新的缺失位點也逐漸被發現，如在AZFb與AZFc區域之間發現了新的缺失位點，即AZFd區域；但目前新發現區段的缺失在臨床上并無明確的臨床意義，它們常常伴隨其他區段缺失，而非獨立存在。到目前為止，在AZF區域中與精子的發生密切相關的候選基因尚未有報道，所以AZF區域缺失的臨床意義仍有較多的爭議[9]。

本研究選擇2013年版歐洲男科協會/歐洲分子遺傳質量協作網關于Y染色體微缺失檢測指南推薦的6個位點，對362例患者的進行AZF區域檢測，結果發現Y染色體微缺失率為7.7%，其中AZFb、AZFc、AZFbc、AZFabc位點缺失率分別為0.6%、5.8%、0.8%、0.6%。可見，AZFc位點缺失在不育患者中的發生率最高，具有各種臨床表型和組織學類型[10]。AZFc參與調控精原細胞向成熟精子的發生過程，這個區段的缺失通常會造成精子生成不足。有報道指出，在AZFc位點缺失的少精癥患者中，精子數目呈進行性減少，臨床上最終進展為無精癥。若患者少精且AZFc位點缺失，則需要提前冷凍保存精液。在AZFc位點缺失的無精癥患者中，約半數可以借助睪丸切開取精術（testicular sperm extraction，TESE）得到精子，并進行單精子卵胞漿顯微注射輔助生育，然而由于Y染色體伴性遺傳的存在，這些患者的男性后代會獲得AZFc位點缺失，因此上述患者在行單精子卵胞漿顯微注射輔助生殖時，建議進行優生學上的性別干預[11-12]。AZFb、AZFbc位點缺失患者的睪丸組織學特點主要有精子阻滯引發無精癥或唯支持細胞綜合征，采取睪丸組織切取術仍無法得到精子。當AZFb位點缺失時，會直接阻礙精原干細胞減數分裂期的發展，呈現生精阻滯，并伴隨各種臨床表現，精子多處于精母細胞階段、精子細胞階段。本研究結果顯示，AZFa位點單獨缺失情況并未出現。當AZFa位點缺失時，患者的睪丸體積明顯縮小，不能產生精子，也不能通過顯微取精獲得精子，且出現唯支持細胞綜合征、無精癥的臨床表現。

在男性不育的原因中，染色體核型異常是另一個不可忽視的遺傳因素，目前最主要的染色體核型異常原因是Klinefelter綜合征。Klinefelter綜合征患者在有絲分裂階段、減數分裂階段，染色體聯會紊亂，性染色體不分離，形成含有兩個X的卵子，進而對男性性狀基因產物表達產生一定的影響，最終表現出精子形成障礙、生殖器官發育不正常、激素水平不正常等。相關研究表明，Klinefelter綜合征涉及的主要染色體核型為47,XXY和47,XYY，還有一部分是嵌合型（46,XY/47,XXY和46,XX/47,XXY）[13]。對于染色體核型異常患者，應通過細胞遺傳學檢測確定病因，積極尋求遺傳學咨詢并決定是否采取輔助生殖。

本研究還對男性不育患者的性激素水平作了檢測，發現無精癥組、嚴重少精癥組FSH、LH水平均明顯高于精液正常組，而3組患者T和PRL水平比較差異均無統計學意義。Pandey等[14]研究發現，Y染色體微缺失的無精癥和嚴重少精癥患者LH及FSH水平明顯升高。下丘腦-垂體-睪丸性腺軸對男性睪丸生精能力具有調節、控制的作用，在促性腺激素釋放激素的作用下，腦垂體會生成LH、FSH。通過FSH的影響，促使精母細胞形成成熟的精子細胞；通過LH的影響，促進睪丸間質細胞的增生，提高間質細胞水平，進而形成精子。若生精上皮細胞未出現異常，來源于支持細胞的抑制素會發揮著抑制作用，降低FSH水平；若支持細胞-生精小管復合體出現異常，則抑制素的分泌水平會降低，負反饋減弱，導致FSH水平升高。LH、T分泌在下丘腦-垂體-睪丸性腺分泌軸內分泌調控中是負反饋關系，當睪丸間質細胞受損時，來源于間質細胞分泌的T水平會降低，LH水平升高[15]。可見，檢測男性不育患者性激素水平變化，有助于判斷睪丸病理改變和功能狀態。對于一些非梗阻性無精癥患者，建議在TESE前進行性激素水平檢測，若FSH高于正常值的2倍及以上則不建議行TESE。

綜上所述，無精癥和嚴重少精癥與Y染色體、染色體核型異常和性激素水平等具有密切聯系，但其相關機制十分復雜。隨著輔助生殖技術的發展，對于一些無精癥和嚴重少精癥患者，可以借助TESE獲得精子并行單精子卵胞漿顯微注射輔助生殖。在開展輔助生殖治療時，建議聯合行Y染色體微缺失、染色體核型和性激素水平測定，為患者提供全方位的個性化遺傳咨詢。