大蒜素在替莫唑胺誘導腦膠質瘤細胞耐藥中的作用及其機制研究

陳景南 王承 杜杭根

膠質瘤是一種常見的腦腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%[1]。近年來雖然治療技術有了很大的提高，但整體療效始終欠佳，因而迫切需要探索新的有效療法[2]。臨床實踐表明，替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一種DNA烷基化抗腫瘤藥，能起到延緩腫瘤進展、延長患者生存期等作用，目前是用于神經(jīng)膠質瘤的一線治療藥物。但是最近研究表明，TMZ的治療效能因腫瘤的化學耐藥性而受到限制，這已成為治療神經(jīng)膠質瘤的主要障礙[3-4]。因此，研究TMZ耐藥的潛在機制迫在眉睫。大蒜素是大蒜的主要生物活性成分，已有多項研究證明其對多種腫瘤細胞具有殺傷作用。在前期研究中，筆者同樣發(fā)現(xiàn)大蒜素具有抗膠質瘤的作用。然而，大蒜素能否促進TMZ耐藥的腦膠質瘤細胞凋亡，增強TMZ的化療敏感性，目前尚未見報道。本研究選取TMZ耐藥的腦膠質瘤細胞系U87/TMZ作為研究對象，探討大蒜素在TMZ誘導腦膠質瘤細胞耐藥中的作用及其機制，為大蒜素更好地應用于臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞和主要試劑 TMZ耐藥腦膠質瘤細胞系U87/TMZ、FBS（上海賽百慷生物技術股份有限公司）；大蒜素、抑制劑 LY294002(美國 Sigma公司)；TMZ(規(guī)格：100 mg，批號：H20130603，濟寧泰諾化工有限公司)；抗磷酸化蛋白激酶（phosphorylated protein kinase，p-AKT）抗體、抗蛋白激酶（protein kinase，AKT）抗體、抗基質金屬蛋白酶抑制劑（matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP）1抗體、TIMP2抗體、抗基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2抗體、MMP-9 抗體（美國Cell Signaling公司）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗分組與處理 體外培養(yǎng)U87/TMZ，待細胞生長至對數(shù)生長期后隨機分為4組，分別加入0、10、25、50 mg/L的大蒜素，置于含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集細胞并檢測磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT 相關蛋白表達、TIMP1及MMP-2等相關蛋白表達及細胞凋亡率；加入50 μM抑制劑LY294002處理細胞1 h，收集細胞并檢測細胞凋亡率。

1.3 相關蛋白表達檢測 采用Western blot法。（1）PI3K/AKT相關蛋白表達檢測：收集上述4組細胞，用RIPA細胞裂解液裂解，在4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液，即蛋白質樣品。使用BCA蛋白質測定試劑盒測量蛋白質含量。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質樣品并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。轉移后，膜在封閉溶液中孵育，加入抗p-AKT抗體，4℃孵育過夜，次日洗滌后加入相應二抗，室溫孵育2 h后再次洗滌5 min×3次，于暗室發(fā)光。以AKT為內參對照，實驗重復3次，取平均值。（2）TIMP1、MMP-2等相關蛋白表達檢測：大蒜素25 mg/L處理24 h后收集細胞，其余操作同上述步驟；其中加入的抗體為抗MMP-2抗體（1:500）、抗 MMP-9抗體（1:500）、抗 TIMP1抗體（1:500）、抗 TIMP2抗體（1:500），內參對照為GAPDH。

1.4 細胞凋亡率檢測 采用MTT法。將細胞接種于96孔板，孵育過夜，次日加入10、25、50 mg/L大蒜素，5% CO2、37 ℃孵育 24 h，加入 20 μl MTT 溶液（濃度為5 mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后棄液，PBS沖洗2～3次，再加入含MTT的培養(yǎng)液。小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，置搖床上低速震蕩約10 min，使結晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測量吸光度值。以二甲基亞砜處理的細胞作為對照，計算細胞凋亡率。實驗重復3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。不同濃度大蒜素處理細胞后PI3K/AKT相關蛋白表達量、細胞凋亡率比較采用單因素方差分析；0、25 mg/L大蒜素處理細胞后TIMP1、MMP-2等相關蛋白表達量比較采用兩獨立樣本t檢驗；LY294002阻斷前后細胞凋亡率比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度大蒜素處理細胞后PI3K/AKT相關蛋白表達量比較 隨著大蒜素濃度的增加，p-AKT蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度大蒜素處理細胞后磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/抗蛋白激酶（AKT）相關蛋白表達的電泳圖（p-AKT為磷酸化AKT）

2.2 0、25 mg/L大蒜素處理細胞后TIMP1、MMP-2等相關蛋白表達量比較 與0 mg/L組比較，25 mg/L組TIMP1、TIMP2蛋白表達量均明顯增加（均P＜0.05），而MMP-2、MMP-9蛋白表達量均明顯減少（均P＜0.05），見圖2。

圖2 0、25 mg/L大蒜素處理細胞后抗基質金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）1、抗基質金屬蛋白酶（MMP）-2等相關蛋白表達量比較（與0 mg/L組比較，*P＜0.05）

2.3 LY294002阻斷前后細胞凋亡率比較 與阻斷前相比，10、25、50 mg/L 組加入抑制劑 LY294002 阻斷后，細胞凋亡率均明顯升高（均P＜0.05）；隨大蒜素濃度增加，細胞凋亡率逐漸升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 LY294002阻斷前后細胞凋亡率比較（與阻斷前比較，*P＜0.05）

3 討論

神經(jīng)膠質瘤是目前最常見的一種原發(fā)性腦腫瘤，大多數(shù)惡性神經(jīng)膠質瘤具有高度增殖性和浸潤性，因而治愈率通常較低[5-6]。另外，神經(jīng)膠質瘤患者的預后不容樂觀，中位總生存期約為12個月[7]。目前膠質瘤的主要治療手段是手術切除，但神經(jīng)膠質瘤難以通過手術完全切除。盡管TMZ、順鉑等化療藥物對神經(jīng)膠質瘤具有抗腫瘤作用，但由于其固有性和獲得性耐藥，大多數(shù)神經(jīng)膠質瘤患者對化療的反應較差。因此，如何增強對TMZ的敏感性是研究重點。大蒜素具有明顯的抗癌功效，可作為各種腫瘤（如胃癌、肺癌、膠質瘤等）的一線化療藥物[8]，故本實驗擬研究大蒜素在TMZ誘導腦膠質瘤細胞耐藥中的作用及其機制。

PI3K/AKT信號通路是神經(jīng)膠質瘤細胞生長、遷移和侵襲的關鍵調控途徑。近來研究表明，可能與程序性死亡受體1可以優(yōu)先與多種PI3K/AKT信號傳導蛋白結合有關，其可導致細胞侵襲的促進和免疫應答的抑制[9]。關于PI3K/AKT信號通路對TMZ敏感性的影響，Huang等[10]認為激活的PI3K/AKT信號通路是膠質母細胞瘤干細胞中miR-223/PAX6介導的TMZ敏感性降低的原因。據(jù)報道，抑制PI3K/AKT信號通路后，TMZ敏感性也得到增強[11]。本研究結果顯示，加入大蒜素后，U87/TMZ細胞中PI3K/AKT信號傳導通路活化情況明顯減弱，且隨著大蒜素濃度的增加而逐漸降低，這表明TMZ耐藥與PI3K/AKT信號傳導通路活化有關，而大蒜素的作用在于降低其活化性，從而提高TMZ治療膠質瘤的療效，增強其敏感性。另外，本研究加入PI3K/AKT信號傳導通路的抑制劑LY294002后，細胞凋亡率明顯升高，也說明PI3K/AKT信號傳導通路與TMZ耐藥密切相關。

腦膠質瘤侵襲是一個復雜的病理、生理過程，與多個基因的改變密切相關。MMP是一個肽鏈內切酶家族，依賴Zn2+發(fā)揮作用，主要在細胞外基質中起降解作用，破壞腫瘤細胞的組織學屏障。MMP-2、MMP-9是一種膠原酶，是MMP家族中的主要成員，參與腫瘤侵襲轉移、血管新生、抑制細胞凋亡等過程。因此，MMP-2和MMP-9被認為是開發(fā)抗癌藥物的重要靶標。TIMP是由TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4組成的哺乳動物蛋白家族，它們共同顯示廣泛的序列同源性和結構相似性。據(jù)報道，TIMP是天然的MMP抑制劑，可通過取消金屬蛋白酶家族所有活化成員的水解活性來防止細胞外基質的降解[12-13]。MMP和TIMP的異常表達可能會影響基質蛋白的重構、形成和降解，誘導癌細胞的侵襲。本實驗在耐藥細胞中加入大蒜素后，TIMP1、TIMP2蛋白表達量均明顯增加，而MMP-2、MMP-9蛋白表達量均明顯減少，這表明MMP和TIMP之間具有平衡性，并且大蒜素具有改變TIMP/MMP平衡的作用。

綜上所述，腦膠質瘤細胞對TMZ的耐藥與PI3K/AKT信號傳導通路活化有關，而大蒜素能夠提高TMZ治療腦膠質瘤的療效，增強TMZ的敏感性，其作用機制是通過阻斷 PI3K/AKT信號傳導通路，上調TIMP1、TIMP2表達并下調MMP-2、MMP-9表達，從而改變TIMP/MMP平衡，發(fā)揮治療作用。這為臨床耐TMZ的腦膠質瘤患者化療藥物的篩選提供了新的思路，并為大蒜素用于臨床治療膠質瘤提供理論依據(jù)。