不同水平自噬對替莫唑胺抑制神經膠質瘤細胞增殖的影響

汪濱 王青霞 虞歡東 于海濤

神經膠質瘤是原發性腦腫瘤中最為常見的惡性腫瘤，占所有原發性腦腫瘤的54%[1]。近年來雖然臨床上嘗試了不少治療神經膠質瘤的新方法，但是目前仍以手術切除為主，術后輔以放化療[2-3]。由于神經膠質瘤侵襲性強，腫瘤組織邊界模糊，手術很難完全切除[4]，因此術后放化療十分重要。替莫唑胺作為第二代口服烷化劑，可穿過血腦屏障，是目前治療神經膠質瘤的主流化療藥物[5-7]。有文獻報道限制替莫唑胺治療效果的主要原因在于神經膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性會逐漸降低[8]，故提高神經膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性是治療成敗的關鍵。自噬是指細胞內溶酶體降解自身細胞器及其他大分子的過程[9]，參與機體的許多生理及病理過程。研究表明，在腫瘤發生、發展的不同階段，自噬均發揮著重要的調控作用[10]。有文獻報道在腫瘤臨床治療過程中可以通過調控自噬來提高腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性[11]。然而，神經膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性與自噬的關系十分復雜。Jalota等[12]將2-脫氧葡萄糖與替莫唑胺聯合作用于神經膠質瘤細胞，結果發現抑制自噬可以提高膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性。Stojcheva等[13]研究發現，通過靶向敲低miR-138增強膠質瘤細胞的自噬，也能提高膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性。可見，不同水平的自噬會對細胞產生不同的影響。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一種自噬的激動劑，能夠促進自噬。因此，本研究利用RAPA預處理人膠質瘤細胞，以探討不同水平自噬對替莫唑胺抑制神經膠質瘤細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞與試劑 人膠質瘤細胞U87購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；RPMI 1640培養液（批號：AD17321266）、FBS（批號：10270-106）均購自美國Gibco公司，毛地黃皂苷（批號：D806779）購自杭州諾揚生物技術有限公司，兔抗微管相關輕鏈蛋白3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）抗體（批號：14600-1-AP）購自美國Sigma公司，山羊抗兔IgGHRP抗體（批號：BST12B08A55）購自杭州聯科生物技術有限公司，RAPA（批號：53123-88-9）購自上海生工生物工程有限公司，RT-PCR試劑盒（批號：AB1455A）購自大連寶生物工程有限公司，RNA提取試劑盒（批號：P4613）購自北京天根生化科技有限公司，MTT染色液（批號：M2128）購自上海碧云天生物技術有限公司，二甲基亞砜（批號：R049169）購自杭州邦易化工有限公司。

1.2 細胞處理與檢測 使用0（對照）、10、25、50 μg/L的RAPA預處理U87細胞0.5 h；再加入200 μmol/L替莫唑胺作用24 h，收集U87細胞。采用流式細胞術檢測自噬標志物LC3-Ⅱ表達量，RT-PCR法檢測自噬相關基因Beclin-1 mRNA相對表達量，MTT法檢測細胞增殖抑制率。

1.2.1 LC3-Ⅱ表達量檢測 采用流式細胞術。取U87細胞，PBS清洗2次，加入250 mg/L毛地黃皂苷處理5 min；1 000 r/min離心5 min，棄上清液；預冷PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定20 min；1 000 r/min離心5 min，棄上清液；預冷PBS洗滌2次。加入兔抗LC3（1:200稀釋）室溫孵育30 min；1 000 r/min離心 5 min，棄上清液；預冷PBS洗滌3次。加入異硫氰酸熒光素標記的山羊抗兔IgG-HRP抗體（1∶500稀釋）室溫孵育1 h；1 000 r/min離心5 min，棄上清液；預冷PBS洗滌3次。流式細胞儀上機檢測，參數設為激發波長492 nm，發射波長520 nm，記錄平均熒光強度，即LC3-Ⅱ表達量。

1.2.2 Beclin-1 mRNA相對表達量檢測 采用RTPCR法。取U87細胞，按照RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，使用DNA/RNA分光光度儀測定RNA的濃度，并根據濃度對各份標本中提取到的總RNA進行稀釋，以保證各份標本擴增前的起始RNA濃度一致。Beclin-1和內參基因的引物序列見表1。反應體系為2×One Step SYBR RT-PCR Buffer 12.5 μl，Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μl，上下游引物（10 μM）各 1 μl，RNA 模板 2 μl，無酶水 7.5 μl。PCR 擴增條件為 42 ℃逆轉錄 5 min，95 ℃預變性 10 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72℃ 15 s，30個循環。采用2-ΔΔct法計算目的基因的mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.2.3 細胞增殖抑制率檢測 采用MTT法。取U87細胞培養孔，每孔加入10 μl MTT染色液（5 g/L）繼續培養4 h；棄上清液，加入100 μl二甲基亞砜，室溫下振蕩10 min；使用酶標儀讀取各孔波長560 nm處的光密度值。細胞增殖抑制率=1-光密度值實驗組/光密度值空白組×100%。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組細胞自噬標志物LC3-Ⅱ表達量的比較 對照組、10 μg/L 組、25 μg/L 組和 50 μg/L 組 U87 細胞LC3-Ⅱ表達量分別為 1.53±0.16、2.46±0.21、5.42±0.29和 7.71±0.55，差異有統計學意義（P＜0.05）；經兩兩比較發現，隨著RAPA濃度的增加，LC3-Ⅱ表達量逐漸升高（均 P＜0.05），見圖1。

圖1 4 組細胞自噬標志物微管相關輕鏈蛋白 3（LC3）-Ⅱ表達的流式細胞圖（a：對照組；b：10 μg/L 組；c：25 μg/L 組；d：50 μg/L 組）

2.2 4組細胞自噬相關基因Beclin-1 mRNA相對表達量比較 4組U87細胞Beclin-1 mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；經兩兩比較發現，隨著RAPA濃度的增加，Beclin-1 mRNA相對表達量逐漸升高（均 P＜0.05），見表2。

表2 4組細胞自噬相關基因Beclin-1 mRNA相對表達量比較

2.3 4組細胞增殖抑制率比較 4組U87細胞增殖抑制率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；經兩兩比較發現，10 μg/L組細胞增殖抑制率明顯低于對照組（P＜0.05），而 25 μg/L 組、50 μg/L 組細胞增殖抑制率均明顯高于對照組（均P＜0.05），見表3。

3 討論

神經膠質瘤是發生于神經外胚層的一組腫瘤，其惡性程度和病死率均非常高[14]。手術切除是目前治療神經膠質瘤的核心方案，雖然手術完全切除是神經外科醫生追求的目標，但是由于受各種客觀條件的限制，往往只能選擇腫瘤次全切除，因此術后放化療十分重要。替莫唑胺是目前臨床上膠質瘤化療的首選一線藥物，其經胃腸道消化吸收，易通過血腦屏障，毒副反應較小。但是在化療過程中，神經膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性逐漸降低甚至出現耐藥等情況嚴重影響了化療的效果。為了提高神經膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性，臨床上也進行了積極的探索，如通過調控自噬來提高神經膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性等。然而，不同的研究團隊報道的研究結果不盡相同，這表明神經膠質瘤細胞對替莫唑胺敏感性與自噬的關系十分復雜，有學者推測自噬的雙重作用可能與神經膠質瘤細胞的類型、活性及所處的微環境等有關[15]。

研究表明，自噬是一把“雙刃劍”，既能促進腫瘤細胞增殖，也能抑制腫瘤細胞增殖[16]。替莫唑胺是通過對神經膠質瘤細胞的DNA進行甲基化修飾，進而誘導神經膠質瘤細胞凋亡，從而起到抑瘤作用的[17]。自噬在DNA損傷修復中同樣扮演著雙重角色。適度的自噬有利于神經膠質瘤細胞對DNA損傷的修復。一方面，自噬可以通過調控同源重組修復通路中的多種蛋白提高同源重組修復水平，如特異性降解異染色質蛋白1α，從而促使DNA修復酶RAD51招募到損傷位點[18]；另一方面，自噬降解自身細胞器及其他大分子，為DNA損傷修復提供能量和原料[19]。過度的自噬則會大量降解DNA同源共組修復啟動的關鍵蛋白核酸內切酶Sae2，導致DNA損傷修復能力顯著降低[20]。本研究利用RAPA預處理人膠質瘤細胞，探討了不同水平自噬對替莫唑胺抑制神經膠質瘤細胞增殖的影響。通過檢測自噬標志物LC3-Ⅱ表達量、自噬相關基因Beclin-1 mRNA相對表達量及細胞增殖抑制率發現，隨著自噬水平的提高，替莫唑胺對神經膠質瘤細胞的增殖抑制率先下降后逐漸升高，這可能與自噬在DNA損傷修復中的雙重作用有關，提示適度的自噬有利于神經膠質瘤細胞修復替莫唑胺造成的DNA損傷，而過度的自噬會抑制神經膠質瘤細胞的DNA損傷修復能力，即適度的自噬可下調替莫唑胺的抑瘤作用，而高水平的自噬會增強替莫唑胺的抑瘤作用。因此，筆者推測不同的研究團隊在自噬與神經膠質瘤細胞對替莫唑胺敏感性的關系研究中得到截然不同的結果，很可能與所使用的神經膠質瘤細胞類型、活性及所處的微環境以及神經膠質瘤細胞的基礎自噬水平等不同有關。

綜上所述，不同水平自噬對替莫唑胺抑制神經膠質瘤細胞增殖產生不同的影響，隨著自噬水平的提高，替莫唑胺對神經膠質瘤細胞的增殖抑制率先下降后逐漸升高。本研究結果為臨床上更好地提高神經膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性提供了實驗基礎。