腦震寧方對模型大鼠腦組織神經元的保護作用*

趙樂，劉海霞，劉濤，竇殿奎，張晨曦，王超群，3，王永輝，王旭文

(1.山西中醫藥大學基礎醫學院，晉中 030619；2.山西振東生物制藥有限公司，晉中 030600；3.湖北中醫藥大學基礎醫學院，武漢 430065)

腦震蕩屬于原發性顱腦損傷中常見的輕度腦損傷，多見于交通意外、運動、軍隊訓練、爆破等。患者在頭部受到劇烈撞擊后出現的意識障礙、記憶力缺失、及惡心、嘔吐等[1]在休息后可恢復，但部分患者會留有頭痛、眩暈、失眠[2-4]等后遺癥。腦震寧方于2017年入選首批“山西名藥”名錄，為行氣活血、養心安神的有效方劑。臨床研究證實，其對腦外傷和顱內血腫等有確切療效，且對腦震蕩后出現的頭痛、頭暈、健忘、失眠等均有緩解作用[5]。本實驗探討腦震寧方對腦震蕩神經元結構和功能相關介質的作用，為腦震蕩的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD大鼠，體質量(170±10) g，64只，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006，合格證號：11400700352037。實驗通過山西中醫藥大學動物倫理委員會批準，大鼠飼養于山西中醫藥大學實驗中心動物房，飼養環境：溫度(22±2) ℃，濕度(50±10)%，24 h晝夜節律光照。適應性喂養1周后開始實驗。

1.1.2藥材與試劑 腦震寧顆粒(山西振東安特生物制藥有限公司，批號：201803)，吡拉西坦(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：6180306)，甲苯胺藍染液(北京雷根生物技術有限公司，批號：1031A18)，Weil 髓鞘染色液(Bioswamp公司，批號：CY1710)，誘導型一氧化氮合成酶(institute nacional de obras sanitarias，iNOS)、基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、白細胞介素6( IL-6)一抗(Bioswamp公司，批號：PAB43765，PAB40457，PAB32097，PAB40563)，二抗試劑盒(武漢博士德公司，批號：12L2B)，二氨基聯苯胺顯色劑(Bioswamp，批號：PAB180021)，Trizol(Ambion公司，批號：15596026)，YBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystems公司，批號：KM4101)，逆轉錄試劑盒(Takara公司，批號：639505)。

1.1.3儀器 組織包埋機及冷凍機(泰維科技有限公司，TB-718D，TB-718L)，石蠟切片機(徠卡顯微系統有限公司，RM2235)，恒溫烘箱(上海恒一科學儀器有限公司，DHG-9023A)，正置顯微鏡(徠卡顯微系統有限公司，DM1000)，熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備 按照隨機數字表法隨機選取54只大鼠，采用金屬單擺閉合式[6-7]擊打大鼠腦顳部，角度70 °，制備單純性腦震蕩大鼠模型，同時滿足下列條件者納入實驗模型：①大鼠受撞擊后即刻出現一過性呼吸頻率減慢或暫停，但不超過20 s逐漸恢復呼吸節律；②翻正反射消失，但不超過3 min，恢復后無運動障礙。

1.2.2分組及給藥 將造模成功的50只大鼠采用隨機數字表法分為5組，依次為模型對照組，吡拉西坦組和腦震寧小、中、大劑量組，每組10只。造模24 h后，各組大鼠分別灌服相應藥物，劑量(根據藥理實驗大鼠和人體給藥體表面積公式換算)分別為：腦震寧大、中、小劑量組10.0，5.0，2.5 g·kg-1，吡拉西坦組0.324 g·kg-1，每天1次。另取正常大鼠10只作為正常對照組。正常對照組和模型對照組大鼠分別灌胃等體積純化水，均連續21 d。

1.2.3指標檢測

(1)一般狀態觀察。每日觀察大鼠自主活動行為，攝食量、飲水量、皮膚毛色變化等。

(2)取材。末次給藥24 h后，麻醉大鼠處死后，冰盤中開顱取腦組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水、透明、石蠟包埋，切片后待染色。

(3)Weil氏染色觀察髓鞘分布。對空白切片組織行常規Weil氏染色，顯微鏡下觀察大腦胼胝體、腦干、小腦白質等部位神經髓鞘排列。

(4)甲苯胺藍染色檢測尼氏體表達。常規甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察腦組織內尼氏體表達，并利用Image-6.0對尼氏體平均吸光度進行分析。

(5)免疫組化檢測腦組織iNOS、IL-6、GFAP和MMP-9蛋白表達。對切片組織進行常規免疫組化染色后(一抗濃度均為1：300)，顯微鏡下觀察并分析組織IL-6、iNOS、GFAP和MMP-9的陽性表達。

(6)RT-PCR檢測腦組織細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、IL-6和MMP-9 mRNA表達。對腦組織海馬取材后，依次進行總RNA提取、反轉錄、基因擴增，以2-△△CT法計算各指標的mRNA表達。PCR擴增條件為：95 ℃，10 min；60 ℃，60 s；72 ℃，5 min；40個循環。β-actin為內參，IL-6、ERK和MMP-9引物序列見表1。

表1 ERK、IL-6和MMP-9 引物序列Tab.1 Primer sequences of ERK，IL-6 and MMP-9

2 結果

2.1腦震寧方對腦震蕩模型一般狀況的影響 實驗期間，模型對照組大鼠精神躁狂，警惕性增強，被毛萎黃臟亂，攝食減少；各給藥組大鼠隨給藥時間延長狂躁表現逐漸改善，攝食逐漸增加。

正常對照組大鼠各部位神經髓鞘排列整齊，無斷裂、彎曲腫脹等現象；模型對照組神經髓鞘排列紊亂，甚至彎曲腫脹、變形或斷裂；各治療組大鼠髓鞘彎曲腫脹減輕，其中吡拉西坦組和腦震寧中、大劑量組大鼠神經髓鞘破壞恢復程度較好，見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖1 6組大鼠腦組織神經髓鞘排列(Weil氏染色，×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.1 Arrangement of nerve myelin sheath in brain tissues of six groups of rats(Weil stain，×200)

2.2腦震寧方對腦震蕩模型腦組織內尼氏體表達(吸光度)的影響 正常對照組腦組織神經元細胞質內尼氏體深藍色；模型對照組較正常對照組神經元尼氏體顯著減少(P<0.05)，且染色淡淺；各治療組大鼠神經元尼氏體染色加深，與模型對照組比較，吡拉西坦組和腦震寧小、中劑量組尼氏體顯著增加(P<0.05)，見表2和圖2。

表2 6組大鼠腦組織尼氏體的表達(吸光度)Tab.2 Expression of Nissl body in brain tissues of six groups of rats(absorbance)

2.3腦震寧方對腦震蕩模型腦組織IL-6、iNOS、GFAP和MMP-9陽性表達的影響 見圖3，GFAP、iNOS、IL-6和MMP-9陽性表達呈現淡黃或棕黃色，iNOS和IL-6主要分布在細胞質內，MMP-9主要分布在細胞膜上，GFAP在細胞質和細胞膜均有分布。與正常對照組比較，模型對照組腦組織GFAP、iNOS、IL-6和MMP-9表達顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，各治療組GFAP、iNOS表達顯著降低(P<0.05)，同時，除腦震寧中劑量組外，各用藥組IL-6、MMP-9表達顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 6組大鼠腦組織GFAP、IL-6、iNOS和MMP-9的表達(吸光度)Tab.3 Expressions of GFAP，IL-6，iNOS and MMP-9 in brain tissues of six groups of rats(absorbance)

2.4腦震寧方對腦震蕩模型海馬ERK、IL-6和MMP-9 mRNA表達的影響 與正常對照組比較，模型對照組ERK、IL-6和MMP-9 mRNA表達均顯著升高(均P<0.05)。與模型對照組比較，各治療組IL-6表達均顯著降低(均P<0.05)，同時，吡拉西坦組和腦震寧中劑量組ERK、MMP-9 mRNA表達均顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠腦組織ERK、IL-6和MMP-9 mRNA的相對表達Tab.4 Relative expression of ERK，IL-6 and MMP-9 mRNA in brain tissues of six groups of rats

3 討論

腦震蕩臨床常表現為一過性眩暈、昏迷、記憶缺失，未見腦部影像學異常，導致其在臨床診治中未予以足夠重視。現代病理學研究認為，其發生伴隨腦組織神經細胞損傷。神經元及其軸突是神經信號形成和信息傳遞的重要環節，腦震蕩發生后如未及時救治，出現腦組織缺血缺氧以及炎癥反應等，造成腦組織充血以及細胞變性和壞死等為主的神經元損傷[8]，發生情感和認知障礙等[9]。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖2 6組大鼠腦組織尼氏體的表達(甲苯胺藍染色，×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.2 Expression of Nissl body in brain tissues of six groups of rats(toluidine blue staining，×200)

腦震寧方中地黃和當歸滋陰養血，丹參、丹皮和川芎行氣活血化瘀，酸棗仁、柏子仁安神養血寧心，佐以陳皮、茯苓和竹茹和胃止嘔，全方共奏行氣活血、養血安神、降逆止嘔之功。研究認為，活血化瘀法有抗炎、免疫調節和保護神經血管單元的功能[10]。

現代研究認為，神經細胞中少突膠質細胞是神經元髓鞘形成細胞，星形膠質細胞對神經元結構起支撐和營養作用。此外，小膠質細胞是中樞神經系統唯一的免疫細胞，可調節腦組織內免疫炎癥因子和營養物質表達，調節腦內環境及神經細胞功能。GFAP是膠質細胞的骨架組成蛋白[11]，GFAP過度分泌會導致膠質瘢痕形成，影響神經細胞的再生。MMP-9具有降解細胞外基質的作用[12]。實驗表明，腦震蕩后大鼠腦組織GFAP和MMP-9表達升高，且病理研究顯示，腦組織髓鞘存在明顯腫脹、排列紊亂，以及尼氏體數量減少，說明腦震蕩發生時存在神經細胞結構的異常；腦震寧方可下調模型大鼠神經元GFAP和MMP-9表達，改善髓鞘腫脹以及尼氏體數量減少的神經損傷性病理變化，說明腦震寧方對腦震蕩后腦組織神經元損傷修復和促進再生具有良性調節作用。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖3 6組大鼠腦組織GFAP、IL-6、iNOS、MMP-9細胞陽性的表達(×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.3 Expression of GFAP，IL-6，iNOS and MMP-9 in brain tissues of six groups of rats( ×200)

星形膠質細胞和小膠質細胞不僅參與神經元結構組成，二者還相互耦聯，參與腦組織內的免疫調節和炎癥反應。在腦組織發生缺血缺氧、感染或創傷時，神經膠質細胞激活，其分泌神經營養物質和免疫調節因子，以支持髓鞘蛋白合成，維護神經元微環境穩態的作用被抑制；小膠質細胞則極化為具有刺激炎癥反應的M1型細胞，造成神經元的功能異常和結構損傷[13]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activeated protein kinase，MAPK)與炎癥反應等關系密切，ERK1/2通路是MAPK信號通路的主要組成通路之一。研究證實，炎癥反應可激活MAPK通路，并參與神經性疾病的發生和發展[14]；同時，激活p38MAPK可直接轉錄調控星形膠質細胞中的iNOS和腫瘤壞死因子(TNF)-α等，導致慢性神經炎癥。整合藥理學研究認為，MAPK通路為腦震寧干預腦震蕩的主要信號通路[15]，本課題組研究也發現，腦震蕩模型ERK表達異常升高，同時，腦組織內IL-6、iNOS表達也顯著升高。IL-6是炎癥反應的關鍵因子，其通過β鏈向腦組織各類細胞傳遞信息，誘導神經元分化，參與腦組織炎癥反應[16]；iNOS在顱腦損傷過程中的高表達，使其與氧自由基結合生成強氧化劑，氧自由基清除物質谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶等降低[17]，造成氧化損傷性神經毒性，在加重神經炎癥反應的同時，造成神經細胞腫脹和死亡[18]。

研究發現，ERK激活是MMP-9活化和過度表達的必要條件，且已證實抑制ERK對下調MMP-9表達有很好的作用，MAPK抑制劑P38可明顯減少MMP-9表達[19]。結合MAPK對神經炎癥反應的促進作用，提示神經MAPK通路可能通過神經細胞內炎癥反應參與神經細胞結構的改變。腦震寧方干預后，腦組織ERK及IL-6、iNOS均受到抑制，結合活血化瘀、養血之功效對抗炎及修復腦神經損傷的作用，提示腦震寧方對腦組織神經元的修復作用與其調節ERK信號通路，減輕炎癥反應有關。

綜上所述，腦震蕩發生可能通過ERK通路參與神經炎癥反應，導致神經細胞的過度增生、腫脹等。腦震寧方可抑制IL-6、iNOS及MMP-9、GFAP的表達，從而起到修復神經元結構和功能的作用。腦震寧中劑量組與模型對照組比較差異有統計學意義，大劑量組較小劑量組的變化幅度更小，且差異無統計學意義，提示腦震寧劑量以中劑量組為佳；但是，各劑量組中，IL-6和MMP-9蛋白和基因相對表達量未完全一致，反映腦震寧方對腦震蕩的作用存在基因表達和蛋白表達的不同步性，今后可進一步進行免疫印跡分析，對蛋白和蛋白磷酸化進行定量，從功能激活角度對腦震寧方的有效劑量進行深入探索。