β－煙酰胺單核苷酸對(duì)衰老小鼠的抗氧化作用研究

王思蓉,王言之,李世芬,3,王光路,張靜姝,3△

(1.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京，211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京，211166；3.江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心，江蘇南京，211166；4.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北石家莊，050035)

β－煙酰胺單核苷酸(NMN)，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種關(guān)鍵性輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前體物質(zhì)，其主要功能由NAD+體現(xiàn)[1]，參與許多關(guān)鍵過程，包括能量代謝，基因表達(dá)和DNA 修復(fù)。β－煙酰胺單核苷酸是人體內(nèi)的固有物質(zhì)，同時(shí)也可從如牛油果、西蘭花等[2]蔬菜水果中獲取，檢測發(fā)現(xiàn)其含量在毛豆、牛油果中尤多[3]。David Sinclair 于2019年發(fā)表的《lifespan》書中介紹了關(guān)于β－煙酰胺單核苷酸的研究，引發(fā)免疫學(xué)界、營養(yǎng)學(xué)界的廣泛關(guān)注，但目前對(duì)β－煙酰胺單核苷酸的作用及相關(guān)機(jī)制的研究仍然存在大量空白。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)告，β－煙酰胺單核苷酸對(duì)退行性疾病（如阿茲海默癥[4]、帕金森疾病[5]）具有一定的治療意義。補(bǔ)充一定劑量的NMN能增加NAD+的含量，可促進(jìn)神經(jīng)血管再生，起到線粒體保護(hù)、抗炎抗凋亡的作用[6]。對(duì)于某些罕見疾病如Leigh 綜合征，給予NMN 能延長患該病小鼠壽命并緩解有關(guān)癥狀[7]。為探究β－煙酰胺單核苷酸更多的作用價(jià)值，現(xiàn)將β－煙酰胺單核苷酸作為受試物，分高、中、低3 個(gè)劑量組對(duì)小鼠灌胃并測量MDA、SOD、GSH 的指標(biāo)含量，擬對(duì)β－煙酰胺單核苷酸對(duì)衰老小鼠的抗氧化作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，為相應(yīng)的臨床應(yīng)用和產(chǎn)品研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 配方篩選

抗氧化系列項(xiàng)目配方篩選，配方為單一NMN成分，設(shè)定人體推薦攝入量為250、125、60mg/人/日（60kg），按這3 個(gè)配方組合設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，NMN 由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

選用上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司繁殖的SPF 級(jí)ICR 健康8 月齡雄性小鼠50 只，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生分析檢測中心屏障系統(tǒng)，溫度20～25℃,相對(duì)濕度40%～70%，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2018-0006，合格證編號(hào)：20180006013099。

1.3 試驗(yàn)方法

以上3 種配方，均按人體推薦劑量的10 倍作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)灌胃劑量，將200mg/人/日VC 劑量組作為陽性對(duì)照組，各劑量組用無菌水配制；同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，給與無菌水。小鼠適應(yīng)環(huán)境至少3d，按血清中MDA 水平分為5 組，每組10 只。各劑量組小鼠給予不同受試樣品按0.1mL/10g 體重進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)30d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取血測血清中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量，取肝測肝組織中蛋白質(zhì)羰基含量、還原性谷胱甘肽含量及抗氧化酶活力。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠一般情況的影響

小鼠灌胃前后體重見表1，數(shù)據(jù)處理知，各劑量組與溶劑對(duì)照組相比，各周體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），反映NMN 對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。

表1 對(duì)小鼠各周體重的影響（）

表1 對(duì)小鼠各周體重的影響（）

2.2 小鼠血清中MDA 的影響

由表2 可見，除溶劑對(duì)照組外，各觀察組實(shí)驗(yàn)后MDA 相對(duì)實(shí)驗(yàn)前均存在不同程度的降低，以NMN(125mg/d)、VC(200mg/d)組最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 小鼠血清中MDA 的含量（）

表2 小鼠血清中MDA 的含量（）

注：“*”表示與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.3 小鼠肝組織中蛋白質(zhì)羰基含量

由表3 可見，和溶劑對(duì)照組相比，各劑量組小鼠的蛋白質(zhì)羰基含量均有所減少，其中VC(200mg/d)組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而NMN(125mg/d)組雖然相對(duì)陰性對(duì)照組蛋白質(zhì)羰基含量平均值下降了26.09%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，或與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量偏少存在一定聯(lián)系。

表3 小鼠肝組織中蛋白質(zhì)羰基的含量（）

表3 小鼠肝組織中蛋白質(zhì)羰基的含量（）

注：“*”表示與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.4 小鼠肝組織中SOD 及GSH-PX 活力

由表4 可見，各觀察組小鼠肝組織中SOD 均高于陰性對(duì)照組，以NMN(250mg/d)組效果最明顯，平均相對(duì)增長了72.9(U/mgprot)，NMN(60mg/d)組次之，平均相對(duì)增長了49.9(U/mgprot)。NMN(250、125、60mg/d)及VC(200mg/d)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 小鼠肝組織中SOD 及GSH-PX 活力（）

表4 小鼠肝組織中SOD 及GSH-PX 活力（）

注：“*”表示與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.5 小鼠肝組織中GSH 含量

由表5 可見，NMN（125mg/d）組小鼠肝組織中GSH 高于溶劑對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與VC(200mg/d)組比較，NMN（125mg/d）組小鼠肝組織中GSH 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 小鼠肝組織中GSH 含量（）

表5 小鼠肝組織中GSH 含量（）

注：“#”表示與VC(200mg/d)組比較，P＜0.05。

3 結(jié)論

參照 《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）之抗氧化功能試驗(yàn)的結(jié)果判定，在本實(shí)驗(yàn)條件下，NMN 對(duì)衰老小鼠具有抗氧化作用，且NMN 在125mg/d 的劑量下對(duì)衰老小鼠的抗氧化作用明顯優(yōu)于250mg/d 和60mg/d 劑量組。

4 討論

β－煙酰胺單核苷酸作為輔酶NAD+的前身，其發(fā)揮相應(yīng)的功能作用由NAD+完成。因NAD+分子很難直接進(jìn)入細(xì)胞，故補(bǔ)充NAD+是以服用NAD+前體形式吸收入血液，才能讓其在細(xì)胞內(nèi)得到利用和轉(zhuǎn)化。Zhang Hongbo 等[8]已證實(shí)補(bǔ)充一定劑量的NAD+能改善小鼠的線粒體功能，延長壽命。但NAD+的含量水平以及其氧化還原狀態(tài)卻隨年齡的增大而呈下降趨勢[9]，其導(dǎo)致年齡相關(guān)的NAD+減少的機(jī)制還未被闡明[10]。β－煙酰胺單核苷酸作為NAD+前體在補(bǔ)充NAD+的含量以及增強(qiáng)其相應(yīng)功能具有重要意義，如口服β－煙酰胺單核苷酸能有效加快合成組織中的NAD+，并緩解小鼠年齡相關(guān)的生理衰退[11]。

近年來，針對(duì)抗氧化劑的研究方興未艾，而新型抗氧化劑在疾病防控和治療方面的作用受到越來越多的關(guān)注。自由基、ROS 及其衍生的氧化應(yīng)激物對(duì)可對(duì)機(jī)體健康造成危害，如異常衰老及其衰老相關(guān)疾病[12]、心血管系統(tǒng)疾病、代謝綜合性疾病等[13]。利用β－煙酰胺單核苷酸的抗氧化作用，清除多余生成的自由基、ROS，降低其對(duì)機(jī)體組織的損害，已然成為延緩衰老、治療疾病的新的靶向。補(bǔ)充β－煙酰胺單核苷酸從而增加NAD+含量，能有效抑制活性氧的生成、減少線粒體斷裂，為急性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病提供治療思路[14]。Natalie 等[15]指出β－煙酰胺單核苷酸能夠有效逆轉(zhuǎn)老齡小鼠血管功能和氧化應(yīng)激，是應(yīng)對(duì)老年心血管疾病的有效干預(yù)措施；Wang Tao 等[16]報(bào)道NMN 轉(zhuǎn)移酶3 通過調(diào)節(jié)NAD+的水平對(duì)兔骨髓質(zhì)充質(zhì)干細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激的效果，但其抗氧化的相關(guān)機(jī)制還尚未明確。另外，活性氧是惡性腫瘤的誘因[17]，可引發(fā)腫瘤細(xì)胞的增殖、提高其耐受性，基于此，深化對(duì)β－煙酰胺單核苷酸抗氧化機(jī)制的相關(guān)研究可以為抑制惡性腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展開拓領(lǐng)域[18]。不論作為NAD+前體還是就其本身而言，β－煙酰胺單核苷酸的潛藏價(jià)值都值得人們的深入研究和探討評(píng)估。