不同紅河橙居群果實表型的變異

高玉紅，魏 萌，2，李凱迪，牟鳳娟

（1.西南林業大學 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；2.東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅河橙Citrus hongheensis，為蕓香科Rutaceae柑橘屬Citrus高大喬木，又稱紅河大翼橙，為大翼橙的一個種類，是較為原始的柑橘類型。該物種主要分布于云南紅河流域較為狹窄的區域，生于海拔800～2 000 m的山坡雜木林中，當地哈尼族人稱其“阿蕾”[1-5]。紅河橙的發現為“中國是世界柑橘類植物起源中心之一”這一觀點提供了佐證[6]。紅河橙的翼葉較為發達，比本葉長1～3倍；株高約8 m，花白色，5～9朵排列成總狀花序，稀單花腋生，花絲分離，柱頭較大，花柱長6.5 mm；果淡黃色或黃綠色，大多橢圓形，果皮厚1.5～2.0 cm，油胞較大，果肉白色至淡黃色，味甚酸，微苦；種子長12 mm，寬10～12 mm，厚6～8 mm，種皮較平滑[1,7]。

廣義的遺傳多樣性指地球上所有生物的遺傳信息的總和，反映了物種基因的豐富程度，是研究物種多樣性和生態系統多樣性的基礎[8-9]。作為生態系統中的生產者，植物遺傳多樣性水平對于生態系統功能的調節有著舉足輕重的作用[10]。大量研究結果表明，隨著植物遺傳多樣性水平升高，營養級動物的多樣性也相應增加，從而間接地改變了群落結構甚至是生態系統的結構[11-13]，其中植物種群遺傳變異和維持變異的機制可通過遺傳多樣性來體現[14]。研究植物遺傳多樣性的方法主要有形態標記、染色體標記、等位酶標記和DNA分子標記等[15]。雖然染色體標記、等位酶標記和DNA分子標記能更準確地在某些方面反映出物種的遺傳多樣性，但形態標記仍具有無法替代的地位[16]。經典植物分類學中，花、果、種子性狀是最受重視的植物形態學性狀，果實的果皮和種子是植物繁殖系統的重要特征[17]，果實表型是樹木分類和遺傳研究的重要參考指標。不少學者通過果皮或種子的遺傳多樣性研究，對植物種質資源利用提出了新的建議和方法[18-22]。

近年來，多位國內外學者先后對柑橘屬及其近緣屬的遺傳多樣性進行了研究[23-24]。李映志采用cpSSR和nSSR分子標記法對我國19份野生寬皮柑橘Citrus reticulata和33份地方寬皮柑橘進行品種間遺傳多樣性分析，發現野生柑橘的遺傳多樣性遠大于地方寬皮柑橘[23]。Garcia-Lor等[24]采用nSSR、SNP、Indel等多種分子標記法分析了橘類種質的遺傳多樣性，結果表明大部分寬皮柑橘品種間均不同程度摻雜了枸櫞C.medica、柚C.maxima等的基因，不同的寬皮柑橘互相雜交形成橘的部分品種。關于紅河橙的研究大部分集中于分子遺傳多樣性分析[2-3]以及該種在柑橘分類中的系統地位[25-29]。楊楊等[2]和Yang等[3]采用ISSR分子標記的方法對云南紅河地區的6個紅河橙居群進行遺傳多樣性研究，發現紅河橙的遺傳多樣性較高，認為紅河橙遺傳多樣性水平較高是生境異質化和有限基因流共同作用的結果。牟鳳娟等[30]對紅河橙野生居群和栽培居群的葉表型性狀進行了分析，發現栽培居群有8個表型性狀指標的平均值大于野生居群，野生居群有5個表型性狀指標的平均值稍大于栽培居群，且居群內不同葉表型變異程度不同，同一表型在不同居群間變異程度均不同。目前鮮見紅河橙果實多樣性方面的研究報道。本研究中對紅河橙不同居群的果實表型性狀多樣性進行了分析，旨在為紅河橙的資源利用和保育研究等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年12月初果實成熟期，對分布在云南南部的綠春縣大興鎮、紅河縣甲寅鄉、紅河縣大羊街鄉、元江縣那諾鄉打芒村、元江縣那諾鄉豬街村等5個紅河橙居群進行調查和取樣。每個居群至少取樣10株，不足10株時，取全部結實的植株，每個樣株隨機采集成熟果實，編號待用。

1.2 果實表型性狀指標測定

測量果實高度、果實寬度、果皮厚度、瓢囊厚度，并計算瓢囊與果皮厚度的比值。其中，縱徑為果實高度，橫徑為果實寬度，果皮厚度取果皮最厚處和果皮最薄處厚度的平均值，瓢囊厚度取果實髓心至內果皮距離的最大值和最小值的平均值。

收集果實瓢囊中的種子，洗凈粘液后，自然風干備用。將每單株的所有種子混勻后隨機取樣，每個居群每個樣株至少取50粒種子，分別測量種子的長度、寬度以及厚度，并計算種子長寬比值。

為簡化分析，定義紅河橙果實的形狀表型性狀包括果實高度和寬度，果皮表型性狀包括果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊與果皮厚度的比值，種子表型性狀包括種子長度、種子寬度、種子厚度、種子長寬比。

1.3 數據分析

將紅河橙表型數據錄入Excel 2010軟件中，計算各指標值的平均值、標準差和變異系數。使用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對紅河橙的各項表型指標進行系統分組設計方差分析、差異顯著性檢驗、聚類分析以及主成分分析。系統分組設計方差分析的線性模型為

式中：Yijk為第i個居群第j個植株的第k個觀測值，μ為總均值，Si為第i個居群的居群效應（固定），Tj(i)為第i個居群內單株效應（隨機），ε(ij)k為試驗誤差。

以表型分化系數（Vst）表示居群間變異占遺傳總變異的比例。

式中：為居群間方差分量，бT2為居群內方差分量。

以性狀的變異系數（CV）表示性狀離散程度。

CV=(Ds/V)×100%。

式中：Ds為標準差，為平均值。

2 結果與分析

2.1 不同紅河橙居群果實的表型性狀

5個紅河橙居群果實的表型性狀見表1。

表1 不同紅河橙居群果實的表型性狀?Table 1 Phenotypic characters of C.hongheensis fruit in different populations

由表1可知，豬街村居群的果實高度、果實寬度、瓢囊厚度、瓢囊與果皮厚度比均為最大，說明該居群果實的個頭較大，出肉率較高。打芒村居群的種子長度、種子寬度為最大值，種子長寬比居第2位，種子厚度居第3位，說明該居群種子形狀相對細長。種子最厚的是大興鎮居群，種子長寬比值較小，表明該居群種子最為飽滿，可優先將其作為良種選育的來源。

由表1可知，紅河橙9個果實表型在居群間和居群內均存在豐富的遺傳變異。果實高度、果實寬度、果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊與果皮厚度比、種子長度、種子寬度這7個表型性狀在居群間和居群內存在極顯著差異（P＜0.01）；種子厚度、種子長寬比等表型在居群間存在顯著差異（P＜0.05），在居群內存在極顯著差異（P＜0.01）。

2.2 不同紅河橙居群果實表型性狀的變異分析

不同紅河橙居群果實表型的變異系數見表2。由表2可知，紅河橙果實形狀表型、果皮表型性狀的變異程度相對較大，種子表型性狀的變異程度相對較小。果實形狀表型和果皮表型變異系數為20.76%～31.04%，其中變異程度最大的是瓢囊與果皮厚度比（31.04%），最小為果實高度（20.76%），其變異系數均大于20%，說明不同居群的紅河橙果實形狀和果皮表型性狀差異較大，可考慮將二者作為判別紅河橙居群來源的依據。此外，紅河橙果實4個種子表型性狀的變異系數為13.96%～18.47%，變異系數最大的是種子長度（18.47%），最小的是種子厚度（13.96%）。

由表2可知，不同居群內同一性狀也有差異。果實高度（16.62%）、果實寬度（16.57%）、瓢囊厚度（16.39%）均為大興鎮居群變異程度最大，果皮厚度（28.55%）為甲寅鄉居群的變異程度最大，種子長度（15.06%）和種子寬度（21.32%）均為大羊街鄉居群的變異程度最大，瓢囊與果皮厚度比（30.49%）和種子長寬比（17.45%）均為打芒村居群的變異程度最大，種子厚度（14.06%）為豬街村居群的變異程度最大。綜合來看，居群內果實表型變異系數由大到小排序依次為打芒村群居群（16.83%）、大興鎮居群（15.28%）、大羊街鄉居群（15.01%）、甲寅鄉居群（14.07%）、豬街村居群（13.33%）。

表2 不同紅河橙居群果實表型性狀的變異系數Table 2 Coefficient of variation of fruit phenotypic traits in different populations of C.hongheensis %

2.3 不同紅河橙居群果實表型性狀的分化

不同紅河橙居群果實表型的系統分組設計方差分析結果見表3。由表3可知，紅河橙居群間的方差分量為24.26%～95.58%，居群內為4.39%～75.35%，表明居群間分化程度相對較高，而居群內分化程度較低。從表型分化系數來看，各性狀表型分化系數為24.36%～95.61%，變異程度最大的是瓢囊厚度（95.61%），然后依次是瓢囊與果皮厚度比（93.68%）、果實高度（92.81%）和種子長度（92.51%），變異程度最小的是種子厚度（24.36%）。平均表型分化系數為75.58%，表明居群間表型分化系數為75.58%，居群內分化系數為24.42%，居群間變異是紅河橙果實性狀變異的主要來源。

表3 不同紅河橙居群果實表型性狀的系統分組設計方差分析結果Table 3 Systematic grouping design and analysis of variance of fruit traits in different C.hongheensis populations

2.4 紅河橙果實表型性狀的相關性分析

紅河橙果實表型性狀的相關系數見表4。由表4可知，紅河橙果實的形狀表型、果皮表型、種子表型有不同程度的關聯性。其中，果實高度與果實寬度極顯著正相關，果實高度和果實寬度與果皮厚度、瓢囊厚度、種子長度、種子寬度間均呈極顯著正相關，瓢囊厚度與瓢囊和果皮厚度比、種子長度呈極顯著正相關，種子厚度與果實形狀表現相關性較小，說明紅河橙果實大小和瓢囊厚度與種子大小的關系較為密切。

表4 紅河橙果實表型性狀的相關系數?Table 4 Correlation coefficient of fruit traits of C.hongheensis

2.5 紅河橙果實表型性狀的主成分分析

紅河橙果實表型性狀的主成分分析結果見表5。由表5可知，前3個主成分的累計貢獻率達81.541%。第1主成分的特征值為4.098，貢獻率為45.539%，在其特征向量中，絕對值較高的性狀是果實高度（0.911）、果實寬度（0.905）、瓢囊厚度（0.827）、種子長度（0.821）、種子寬度（0.668），該類性狀與果皮和種子表型有關，故第1主成分為果實形狀因子。第2主成分的特征值為1.853，貢獻率為20.586%，第1主成分和第2主成分的累計貢獻率為66.125%。在第2主成分的特征向量中，絕對值較高的性狀是瓢囊與果皮厚度比（0.815）、果皮厚度（0.805），瓢囊與果皮厚度比反映的是果實的出肉率，與果實品質有關，故第2主成分為果實品質因子。第3主成分的特征值為1.359，貢獻率為15.416%，第1主成分、第2主成分和第3主成分的累計貢獻率為81.541%。在第3主成分的特征向量中，絕對值最高的性狀是種子長寬比（0.873），種子長寬比反映的是種子的飽滿程度，與種子品質有關，故第3主成分為種子品質因子。

表5 紅河橙果實表型性狀的主成分分析結果Table 5 Principal component analysis of fruit traits of C.hongheensis

2.6 不同紅河橙居群果實表型性狀的聚類分析

基于歐式距離對5個紅河橙居群的表型性狀進行聚類分析，結果如圖1所示。由圖1可見，在歐式距離為5時，紅河橙居群被分為3大類，其中第I類包括大羊街鄉、甲寅鄉和大興鎮3個居群，打芒村居群構成第Ⅱ類，豬街村居群為第III類。

圖1 基于歐氏距離的不同紅河橙居群果實表型性狀的聚類分析結果Fig.1 Cluster analysis result of fruit traits of different C.hongheensis populations on Euclidean distance

紅河橙的分布范圍雖然較為狹窄，5個居群在地理位置上較為接近，但其3大類群的劃分與其地理分布格局基本相一致。大羊街鄉、甲寅鄉和大興鎮3個居群的果實表型近似，在地理位置上也更為相近。該大類表現為果實形態略小，瓢囊平均厚度略小，種子較短小。元江縣那諾鄉的豬街村和打芒村在地理位置上較近，但其種實差異較大。豬街村居群的果實最大，種子較大，其果實皮薄肉多，較為飽滿；打芒村居群的果實個頭較大，在外形上呈現“扁圓”的特點，種子最大，略飽滿。暴卓然等[31]報道的紅河橙變種元江大翼橙果實的各表型性狀特征與本研究中元江縣那諾鄉的豬街村和打芒村2個居群的特征相符，這2個居群與其他3個紅河橙居群在果實形態上存在明顯差異。

3 結論與討論

本研究結果表明，不同紅河橙居群間果實形態差異較大，遺傳多樣性豐富，居群間變異是紅河橙遺傳變異的主要來源。其中，果實高度、果實寬度、瓢囊厚度、種子長度、種子寬度等表型是紅河橙居群間果實性狀變異的主要表現，果實形狀和果皮表型變異占了絕大部分比例，因此可將果皮表型作為種質資源評價和良種選育的主要參考指標之一。元江縣那諾鄉打芒村居群的果實變異最豐富，產生優質變異的可能性較高，可考慮將其作為優良種質資源選育的主要來源。

表型多樣性是遺傳多樣性的基礎，經過長期適應和自然選擇，野外物種在不同居群間已經產生明顯的變異和分化，各表型性狀在居群內和居群間均存在豐富的遺傳變異[32-33]。本研究結果表明，紅河橙果實形狀表型（果實高度、果實寬度）、果皮表型（果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊與果皮厚度比）和種子表型（種子長度、種子寬度、種子厚度、種子長寬比）在不同居群間差異顯著，說明紅河橙果實各表型在不同居群間存在著豐富的變異，其果實表型變異主要來源于居群間的變異，與有關麻櫟Quercus acutissima[34]、絲栗栲Castanopsis fargesii[35]、文冠果Xanthoceras sorbifolium[36]以及青海云杉Picea crassifolia[37]等植物果實表型變異的研究結果相似，與板栗Castanea mollissima刺苞的刺束長度變異的研究結果不一致，后者居群內變異是其表型性狀呈多樣性的主要來源[38]。本研究中，紅河橙不同居群間果實形狀表型和果皮表型的多樣性普遍高于種子表型多樣性，果實9個表型性狀的變異系數為13.96%～31.04%，表明紅河橙多樣性水平普遍較高，與楊楊等[2]和Yang等[3]的研究結果相一致。

同一物種在不同居群間發生的變異可以反映出該物種對不同環境的適應能力，物種的變異程度也表明了其適應不同生境的廣泛程度，通常變異程度較大的物種，其適應的生境也越廣[11]。紅河橙果實各表型在居群之間的差異顯著或極顯著，其主要原因可能是受自身的遺傳組成和生境的共同影響，說明紅河橙果實這9個表型性狀的多態性較為豐富，是紅河橙適應環境的具體表現。此外，紅河橙的種子長度、種子寬度、種子厚度這3個性狀的平均值分別是16.52、11.24、5.60 mm，相應的變異系數分別為18.47%、17.65%、13.96%，牟鳳娟等[39]報道西雙版納地區分布的大翼厚皮橙這3個性狀的平均值分別為15.30、6.97、3.89 mm，相應的變異系數分別是10.10%、11.37%、12.34%，與之相比，紅河橙種子更大、更飽滿，變異程度更豐富，且5個居群間的遺傳多樣性水平較高。

據報道，文冠果的株高、地徑、葉長、葉寬、果橫徑、果縱徑、種子長、種子寬等21個表型性狀間的變異明顯，且單株種子質量與多個性狀間存在顯著相關性[40]。相關分析結果表明，紅河橙僅種子長度和種子寬度與果實形狀和瓢囊厚度有極顯著或顯著相關性，其余各指標間相關性較小，說明種子表型的遺傳多樣性可能受基因調控的影響更顯著，受環境影響較小，還有待進一步從其他角度進行深入研究。

主成分分析是在不損失或較少損失原來表型性狀信息的情況下將形態學信息通過降維的方法，分類出若干個綜合因子來反映原先具有眾多性狀變量的信息量，從而簡化形態學的分類工作[40]。本研究中通過對5個不同來源的紅河橙果實的9個表型性狀進行主成分分析，結果表明前3個主成分的累計貢獻率達81.541%，其中果實高度、果實寬度、瓢囊厚度、種子長度、種子寬度等表型是紅河橙果實性狀變異的主要表現，且果實形狀表型和果皮表型變異占了絕大部分比例，這種現象是否為環境飾變產生的結果有待進一步證實[41]。

聚類分析結果表明，在歐氏距離為5時，不同地區的紅河橙被分為3個大類。第Ⅰ類包括紅河縣大羊街鄉、紅河縣甲寅鄉、綠春縣大興鎮3個居群，該類群表現為果實略小，瓢囊平均厚度較薄，種子較短小，形態略微不飽滿，特別是大興鎮居群，其種子最小，推測該3個居群的紅河橙種質來源與元江縣那諾鄉2個居群不同。第II類為元江縣那諾鄉打芒村居群，其果實變異程度最大，變異最為豐富，果實高度和寬度的平均值較大，在外形上呈現“扁圓”的特點，種子長度和寬度最大，厚度適中，從該居群篩選出優質資源的可能性較高，可考慮將其作為優質種質選育材料的重要來源。第III類為元江縣那諾鄉豬街村居群，其果實最大，種子較大，果實皮薄肉多、形態飽滿，可以考慮將其作為中藥“枳殼”的材料來源[29]。

花、葉、果、種子等為植物的重要器官，進行表型研究時應盡可能涵蓋這些器官的性狀。本研究中僅涉及紅河橙果實的形狀表型、果皮表型和種子表型，還應從花、葉及植株等多項表型進行更深入的研究。同時，生境對表型的影響較大，僅通過表型性狀對紅河橙進行多樣性研究存在一定的局限性。后續考慮將表型研究與基因水平的研究相結合，綜合分析紅河橙的遺傳多樣性，并對紅河橙野生資源進行深入調查研究。