體細胞克隆及胚胎移植技術在優質基因種豬群快速擴繁中的應用

陳海云 林曉 滕麗瓊 蘇院司 梁啟賢/南寧壯博生物科技有限公司 530007

體細胞克隆及胚胎移植技術是一種優質的種豬育種技術。種豬行業在豬只養殖行業的上游，擁有豬只繁殖所需的資源與技術，對整個豬只養殖行業極為關鍵。

根據國家統計局最新數據顯示，2021 上半年全國生豬存欄4.4 億頭，能繁母豬存欄4564 萬頭。2018 年，2019 年受到非洲豬瘟影響，種豬市場規模經歷大幅衰退。2019 年末以后，全國各地對豬肉的需求上升，預計2021 年市場規模可達到865 億元。我國每年超過97%的核心純種豬依賴進口。我國育種水平低，國內種豬業長期處于“引種—擴繁—銷售—退化—再引種”惡性循環模式。常規育種幾年甚至十幾年才能培育一頭特級公豬。而運用體細胞克隆及胚胎移植技術一年可以獲得上百頭甚至上千頭的特級公豬。實現優質種豬的快速擴繁，大大提高效率，降低了育種成本。

體細胞克隆技術技術原理是從特級種豬采集少量的耳朵組織體外培養，提取細胞核。選取供體母豬卵巢，提取卵母細胞，去掉細胞核，獲得去核卵母細胞。進行體外融合、體外培養3d，后進行胚胎移植，114d 左右即可獲得克隆后代。現如今研究豬的克隆與基因編輯技術結合，體細胞克隆及胚胎移植技術的改進與提升是該研究的前提。隨著豬的繁殖生物技術的需要，豬胚胎移植技術是豬生產中不可或缺的技術環節，是豬繁殖和改良的重要手段。

相比于誘變育種，雜交育種等這類傳統育種方式，將體細胞克隆及胚胎移植技術相結合，能夠生產出更優質的種豬且耗時少，成本低。對豬的基因組進行修飾，能夠生產出抗病性強的豬。生產出來的優質種豬，就可以進行保種保育，防止其優良品系的流失。該技術能生產出高品質的肉豬，抗病能力更強，肉質好又健康。

1 材料與方法

1.1 試驗動物由廣西壯族自治區南寧市壯博生物科技有限公司提供的長白豬母豬13 頭，豬重均在 200 kg 左右，術前檢查身體狀況健康，良好。采豬的咽拭子進行病毒檢測，結果為陰性后禁食 24h，可以喝少量的水。

1.2 胚胎此實驗的卵母細胞在南寧市的屠宰場中選取，在該屠宰場母豬的豬卵巢中獲取并培養，體細胞用的是五指山豬耳細胞，胚胎由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供。

1.3 試驗器材及藥品常規外科手術器械；鹽酸腎上腺素注射液，購自遂成藥業；鹽酸利多卡因注射液，購自遂成藥業；酚磺乙胺注射液，購自華牧動物保健品；待孕母豬篩選表；開口導管與適配器等。

1.4 麻醉與消毒母豬保定確實后，在耳靜脈消毒后注射麻醉藥；大約注射40mL 麻醉藥后，母豬開始暈眩，大約注射50mL 麻醉藥后，母豬倒地。其中有母豬在注射完50mL 還繼續強烈掙扎，繼續注射達60mL。手術時助理監測記錄各環節母豬心跳頻率，耗時，用藥量與體征狀況。

1.5 術式手術前將母豬麻醉倒地，麻醉完成后，用聽診器探測母豬的心跳頻率，心跳頻率均大致在80Hz 左右為正常。消毒母豬腹部，在接近腹中處用手術刀切開一個大約8cm 左右的口子，手術過程中4 人分別按壓豬的腿部，1 人消毒腹腔刮毛后，將手伸入腹部內準確拉出輸卵管傘，用生理鹽水沖掉溢出的血。術者鋪開輸卵管傘并捋直輸卵管，這時，另一個助手在立體顯微鏡下找出胚胎，在醫用注射器套上約20cm 導管，吸入約200 枚左右的胚胎，植入輸卵管傘的一側子宮。移植完畢后將器官放回腹腔正確位置，用針線縫補好傷口，然后涂抹頭孢，再噴涂血云南白藥，用紗布包好傷口。整個手術過程高效快速，每臺胚胎移植手術不超過10min。

圖1 手術過程

1.6 術后護理手術后，注意觀察受體母豬手術恢復情況，防范手術傷口感染。每天測量體溫2 次，在傷口處涂抹頭孢與魚腥草混合物，1d 1 次，連續3d，如無異常，3d 拆外面的紗布，7d 拆皮膚上線，拆后涂紫藥水，防止發炎。對受體母豬進行細致管理，時刻注意受體母豬的環境衛生，身體狀況，進食情況以及調整飼喂量。

1.7 妊娠診斷

25d 后使用 B 超進行妊娠診斷，第一次診斷間隔25d，第二次診一次診斷間隔55d 左右。

2 結果

手術完成后，初步觀察到13 頭受體母豬在手術后的3d左右，食欲減退不主動吃食，4d 后母豬食欲、體溫與精神狀態均恢復正常，一個月后進行B超檢查，發現有9頭母豬妊娠，1 頭流產，耳號193602 母豬流產，耳號309001 和333402 移植母豬已超預產期，分別注射氯前列醇鈉2 支，未見有小豬產出。本次移植母豬13 頭，實際產仔5 頭母豬，164101，039604，307105，187201，034904，總產21 頭。克隆小豬編號703 由于體重太低（0.37kg），不能吃奶，吞咽困難，已死亡。還有的豬仔的舌頭比較大，不能自主吸奶，體質較弱。本團隊尚未查到相關資料說明克隆豬舌頭偏大的原因，還需進行相關的研究。

表1 試驗豬的生產情況

3 討論

綜上所述，應用胚胎移植技術只需要簡單的保溫設備，一次手術耗時不到10min，相比于普通育種模式有顯著優勢。不僅節約開支而且防止了各種病原的傳播。應用體細胞克隆及胚胎移植技術還需要投入更多的研究，才能更好的保證代孕分娩率與后代存貨率。在后續的實驗中需優化實驗方案，提高團隊的技術水平，配套基因測序技術保障供體質量，顯微操作克隆技術提高效率，母豬的情期管理技術及胚胎精準著床技術提升代孕分娩率。體細胞克隆及胚胎移植技術的應用前景廣闊，未來可期。