再生固體牛糞墊料中細(xì)菌多樣性分析及評(píng)價(jià)

劉建成，曾 軍，丁 峰，許先查，竇晶晶，陳開旭，李鳳鳴，高 雁

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；3. 新疆機(jī)場(chǎng)(集團(tuán))天緣綠色產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司，新疆昌吉 831100)

0 引 言

【研究意義】我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化程度不斷提升[1]。我國奶牛存欄量1 400×104頭，位居世界第3，每年牛糞排放量約6×108t，絕大部分作為有機(jī)廢棄物還田或者隨意堆放[2]，造成其資源沒有最大限度的被利用。牛床是奶牛主要的活動(dòng)區(qū)域，奶牛每天有50%～60%的時(shí)間趴臥于牛床墊料上休息和反芻[3]。牛床墊料的舒適度直接影響奶牛的趴臥時(shí)間，影響其產(chǎn)奶性能、健康水平以及養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，選擇好的牛床墊料對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)具有重要意義[3-5]。【前人研究進(jìn)展】奶牛臥床墊料主要分為無機(jī)臥床墊料和有機(jī)臥床墊料。無機(jī)臥床墊料中常采用沙子、橡膠、水泥地面直接躺臥等。有機(jī)臥床墊料主要有鋸末、木屑、稻殼等。牛糞制奶牛臥床墊料通常是直接晾曬以及好氧發(fā)酵，這些處理方式時(shí)間較長、占地面積大，直接晾曬的還存在病原菌數(shù)量多等問題，易引起奶牛乳房炎。近年來，隨著牛糞墊料再生系統(tǒng)(BRU)的使用，牛糞被轉(zhuǎn)化為含水率低(45%左右)，無臭、松軟、無球狀顆粒料的再生固體牛床墊料(RMS)，已經(jīng)在英國、美國、加拿大、新西蘭等國家普及使用[7-9]。與傳統(tǒng)墊料相比，RMS不僅可以有效解決奶牛場(chǎng)的牛糞污染問題，而且可以減少購買墊料的資金投入，達(dá)到廢物循環(huán)利用的效果，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益[9]。RMS作為奶牛臥床墊料既可以改善臥床的舒適度、增加奶牛的臥床時(shí)間、提高奶產(chǎn)量，而且還可以降低奶牛肢蹄病的發(fā)生率[10-12]。【本研究切入點(diǎn)】經(jīng)BRU系統(tǒng)處理后的RMS中仍然存在一定種類和數(shù)量的微生物，其群落組成、多樣性以及在存放過程中的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)目前外尚未見報(bào)道。評(píng)估牛糞墊料再生系統(tǒng)(Bedding Recovery Unit，BRU)處理的再生固體牛糞墊料(Recycled Manure Solids，RMS)的安全性。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究運(yùn)用高通量測(cè)序分析技術(shù)與傳統(tǒng)細(xì)菌分離、鑒定技術(shù)相結(jié)合，對(duì)BRU系統(tǒng)處理前、處理后及RMS堆存期間物料中所含的細(xì)菌群落組成和多樣性進(jìn)行測(cè)定分析，評(píng)估通過牛糞墊料再生系統(tǒng)(BRU)處理的再生固體牛糞墊料(RMS)的安全性，為養(yǎng)殖場(chǎng)安全合理應(yīng)用RMS提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

將奶牛糞污收集到接收池中，通過攪拌勻漿后，泵送至固液分離設(shè)備。經(jīng)固液分離后把固體牛糞傳送至滾筒式牛糞墊料再生系統(tǒng)(BRU)中，經(jīng)60～65℃高溫好氧自然發(fā)酵16～18 h后排出，堆放存儲(chǔ)待用。

樣品采集于新疆昌吉市某牛場(chǎng)，采集該牛場(chǎng)固液分離后的新鮮牛糞(S1)、經(jīng)BRU系統(tǒng)發(fā)酵處理后出口處的牛糞(S2)以及堆存待用的再生固體牛糞墊料(S3)。樣品S1和S2每2 h采集1次，每次采樣500 g左右，連續(xù)5 d。將每天采集到的樣品混勻后，作為平行樣置于無菌管中液氮保存待檢。樣品S3是將堆存30 d后的RMS從上到下均分為5個(gè)切面，每個(gè)切面隨機(jī)取5個(gè)點(diǎn)，采集物料表面以下50 cm深處的樣品，每個(gè)點(diǎn)采樣500 g左右，將以上樣品在無菌條件下混勻后液氮保存待檢。

1.2 方 法

1.2.1 溫度

樣品S1、S2和S3的物料溫度測(cè)定使用手持式溫度測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，BRU系統(tǒng)內(nèi)的實(shí)時(shí)發(fā)酵溫度通過溫度感應(yīng)器顯示在設(shè)備的液晶儀表屏上。

1.2.2 水分和干物質(zhì)含量

RMS水分及干物質(zhì)的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取樣品25 g于烘干恒重的鋁盒內(nèi)，置于105℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干至恒重，物料損失量即為水分含量，剩余物質(zhì)量為干物質(zhì)含量。

1.2.3 pH的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取樣品25 g于100 mL燒杯中，加50 mL蒸餾水，電磁攪拌10 min，用雷磁pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 微生物數(shù)量測(cè)定

樣品中細(xì)菌總數(shù)參照GB/T 13093-2006《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定》方法進(jìn)行。大腸桿菌參照GB/T 18869-2019《飼料中大腸菌群的測(cè)定》方法進(jìn)行。金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌的測(cè)定：參照NT/T 2962-2016《奶牛乳房炎乳汁中金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、無乳鏈球菌分離鑒定方法》進(jìn)行。沙門氏菌參照GB/T 13091-2018《飼料中沙門氏菌的檢測(cè)方法》進(jìn)行。

1.2.5 細(xì)菌群落組成多樣性

細(xì)菌群落組成多樣性分析采用分子生物學(xué)高通量測(cè)序法，使用糞便基因組試劑盒提取樣品中總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。細(xì)菌高通量測(cè)序擴(kuò)增16S rDNA V4區(qū)，使用引物為515F(GTGYCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTACNVGGGTWTCTAA)[13]。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖進(jìn)行檢測(cè)，將主帶大小在400～450 bp的序列進(jìn)行回收、純化。使用New England Biolabs 公司的NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測(cè)后，使用HiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，所有高通量測(cè)序相關(guān)工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析，每個(gè)樣本測(cè)序深度不低于3×104條，有效序列數(shù)不低于2×104條。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品做5個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)使用Excel 2007進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(X±SD)，采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，其彼此之間比較采用方差分析，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，而對(duì)于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同階段樣品理化指標(biāo)比較

研究表明，與S1相比，牛糞固體物料(S2)經(jīng)過BRU系統(tǒng)好氧發(fā)酵16～18 h后溫度顯著提升(P<0.01)，pH和水分有所下降，干物質(zhì)有所上升，但變化差異均不顯著(P>0.05)。而經(jīng)BRU系統(tǒng)處理后的牛糞在堆存30 d后，物料(S3)溫度與S2相比顯著降低(P>0.05)，水分也繼續(xù)顯著降低，而干物質(zhì)則顯著升高(P>0.05)。與S1、S2相比，牛糞pH值呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。表1

表1 不同階段牛糞樣品的理化指標(biāo)Table 1 Changes of physical and chemical indexes in samples at different stages

2.2 不同階段樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌總量、大腸桿菌、金黃色葡萄糖球菌、病原菌的數(shù)量變化

研究表明，奶牛糞污中細(xì)菌總數(shù)由S1至S3呈現(xiàn)出顯著下降，其中固體牛糞經(jīng)過BRU系統(tǒng)16～18 h高溫好氧發(fā)酵后細(xì)菌總數(shù)下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)(P<0.01)，但RMS在推存30 d后細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)出顯著回升(P<0.01)。大腸桿菌數(shù)量與細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)出相同趨勢(shì)，在BRU系統(tǒng)處理后其數(shù)量極顯著降低一個(gè)數(shù)量級(jí)(P<0.01)，而RMS堆放30 d后，其大腸桿菌數(shù)量與S2相比增加了近4倍(P<0.01)。牛糞經(jīng)過BRU系統(tǒng)處理后，金黃色葡萄球菌數(shù)量變化差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于S3中數(shù)量，都在102cfu/g數(shù)量級(jí)上。無乳鏈球菌和沙門氏菌在所有樣品中都未檢到。表2

表2 不同階段樣品中微生物數(shù)量變化(n=5，cfu/g)Table 2 Changes of the number of microorganisms in different stages of samples

2.3 不同階段樣品中免培養(yǎng)病原細(xì)菌比較

研究表明，檢測(cè)到3個(gè)樣品中存在4個(gè)屬的條件致病菌，分別為Aerococcussp.(氣球菌屬)、Facklamiasp.(費(fèi)克藍(lán)姆氏菌屬)、Paeniclostridiumsp.(厭氧梭菌屬)和Carnobacteriumsp.(肉桿菌屬)，并且這4個(gè)屬全部為BRU系統(tǒng)處理前樣品S1中優(yōu)勢(shì)類群，分別占細(xì)菌總數(shù)的(1.40%±0.8%)、(20.73%±3.97%)、(7.20%±2.35%)和(0.27%±0.15%)，而經(jīng)BRU系統(tǒng)處理后樣品S2以及在堆放樣品S3中均未檢測(cè)到這些類群。

2.4 不同階段樣品中細(xì)菌Alpha多樣性比較

研究表明，在3個(gè)不同階段樣品中分別獲得24 801、22 134和21 098條細(xì)菌的16S rDNA序列。通過設(shè)立21 098條序列進(jìn)行后續(xù)分析，得到多樣性指數(shù)。研究表明，在該測(cè)序深度下3個(gè)樣品的覆蓋率均大于91.00%，測(cè)序深度具有代表性，涵蓋了絕大多數(shù)的微生物群落組成。細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)從S1至S3均呈現(xiàn)出極顯著的下降趨勢(shì)(P<0.01)。高溫發(fā)酵16～18 h對(duì)于細(xì)菌多樣性影響最大，表現(xiàn)在細(xì)菌OTU數(shù)量上減少了57.73%，細(xì)菌豐富度指數(shù)(ACE指數(shù))降低了57.47%，香農(nóng)多樣性指數(shù)降低了81.63%。而經(jīng)過堆放30 d的樣品S3與S2相比OUT數(shù)量顯著下降(P<0.01)，下降了33.33%，細(xì)菌豐富度指數(shù)(ACE指數(shù))降低了53.34%(P<0.01)，但香農(nóng)多樣性指數(shù)卻顯著的增加了21.76%(P<0.01)。基于系統(tǒng)發(fā)育樹的多樣性指數(shù)(PD whole tree)同樣展現(xiàn)出由S1～S3顯著下降趨勢(shì)(P<0.01)，下降最為顯著發(fā)生在S1向S2轉(zhuǎn)變過程。表3

表3 不同階段樣品中細(xì)菌Alpha多樣性變化Table 3 Changes of bacterial richness and diversity in samples at different stages

2.5 不同階段樣品中細(xì)菌Beta多樣性比較

研究表明，3個(gè)樣品分布在不同的3個(gè)象限表明其群落組成的Beta多樣性差異顯著，3個(gè)樣品彼此間差異極顯著(P<0.01)。圖1

圖1 不同階段樣品Beta多樣性及主軸Fig.1 Analysis of Beta diversity and principal axis in samples at different stages

3 討 論

3.1 BRU系統(tǒng)處理后產(chǎn)生的RMS安全性評(píng)價(jià)

牛糞一直是制約奶牛規(guī)模化養(yǎng)殖發(fā)展的一項(xiàng)關(guān)鍵而亟待解決的問題[1]。可導(dǎo)致奶牛乳房炎最主要的病原微生物為金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌和沙門氏菌[3]。分析牛糞墊料中病原菌的種類與數(shù)量是固體牛糞好氧發(fā)酵制備臥床墊料技術(shù)能否安全、科學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵所在，也對(duì)控制疫病的發(fā)生與傳播起著重要的作用。目前，牛糞發(fā)酵牛床墊料沒有相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果顯示，經(jīng)BRU系統(tǒng)處理后RMS中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌數(shù)量下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，金黃色葡萄球菌數(shù)量并未發(fā)生明顯下降，這一結(jié)果說明BRU系統(tǒng)在62℃處理16～18 h對(duì)病原菌的殺滅效果并不理想，增加BRU處理時(shí)間或者提高處理溫度，以期增加病原菌殺滅效率。但是，RMS在堆放30 d后，物料中的金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著下降，表明RMS在堆存過程中持續(xù)的高溫對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著殺滅作用，這與一些研究結(jié)果認(rèn)為糞便中的病原菌需要在高溫下存放30 d才能達(dá)到完全殺滅[14-16]的結(jié)果相一致；而細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌數(shù)量又呈現(xiàn)出了顯著增加的趨勢(shì)，雖然在堆放過程中存在有高溫脅迫，但其依然具有潛在的可能會(huì)增加一些機(jī)會(huì)主義病原菌的重新定植和數(shù)量上的增殖[17，18]。BRU系統(tǒng)處理牛糞墊料使用存在一定的安全隱患，除了需要提高BRU處理溫度和處理時(shí)間以外，還需要堆存一定的時(shí)間，以達(dá)到徹底殺滅病原菌的效果。

3.2 BRU系統(tǒng)處理及堆存對(duì)牛糞中細(xì)菌多樣性的影響

運(yùn)用高通量測(cè)序分析技術(shù)，通過16S rRNA序列分析可以快速有效檢測(cè)出樣品中大量低豐度的微生物，能更加真實(shí)的反映出樣品中微生物的種類和多樣性。研究結(jié)果顯示，經(jīng)BRU處理后細(xì)菌Alpha多樣性呈現(xiàn)出極顯著的下降，各指標(biāo)下降幅度均超過53.00%以上，而基于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和豐度的Beta多樣性分析結(jié)果同樣呈現(xiàn)出極顯著的下降，表明牛糞經(jīng)BRU高溫好氧發(fā)酵后能夠極顯著的降低牛糞中的細(xì)菌種類和多樣性，改變?nèi)郝浣M成[7]。結(jié)果與已有的研究結(jié)果一致，顯示出BRU系統(tǒng)高溫好氧發(fā)酵殺滅牛糞中細(xì)菌的強(qiáng)大作用[4,5,6,8,11]。但在實(shí)際生產(chǎn)中常常存在RMS并不能及時(shí)使用，因此，存在堆放一定時(shí)間后再使用的問題。研究結(jié)果顯示，RMS存放1周后其堆體溫度仍然高于50℃，表明經(jīng)過BRU系統(tǒng)高溫發(fā)酵后，RMS并未發(fā)酵完全，其在堆放過程中仍然在發(fā)酵。主要原因是經(jīng)過BRU系統(tǒng)處理后的牛糞含水50%左右，質(zhì)地松軟通氣性好，因此，其在堆放過程中有利于好氧微生物的生長，因而造成堆體持續(xù)保持較高溫度。持續(xù)的高溫能夠進(jìn)一步造成細(xì)菌種類，豐度和均勻度顯著下降，但細(xì)菌香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)呈現(xiàn)出極顯著的增加，這表明雖然高溫造成一些不耐熱細(xì)菌的死亡，但是一些耐熱或者嗜熱微生物類群豐度的增加使得RMS中細(xì)菌多樣性的增加，并且基于系統(tǒng)發(fā)育的Beta多樣性分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了RMS堆放后細(xì)菌群落多樣性顯著高于堆放前。細(xì)菌多樣性顯著的增加一方面有利于維持其所處生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性，這也是細(xì)菌整體群落對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的抵抗能力和其生態(tài)功能補(bǔ)償?shù)囊环N響應(yīng)，其增加將有助于生態(tài)系統(tǒng)對(duì)外界其他微生物入侵，定植的抵御能力，這也將進(jìn)一步的促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡的恢復(fù)[19]。RMS在經(jīng)過持續(xù)不斷高溫后其細(xì)菌多樣性的降低使得RMS生境中生態(tài)位的空余，因此，這將會(huì)給一些機(jī)會(huì)主義病原微生物(例如一些繁殖，生長迅速的病原菌)留下繁殖的空間。因此，其直接作為墊料使用理論上可能會(huì)具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。而通過堆放一定時(shí)間后隨著生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌多樣性的恢復(fù)其作為墊料使用將會(huì)降低其使用風(fēng)險(xiǎn)，但如果僅任其自然堆放發(fā)酵將會(huì)造成RMS的pH的升高，過堿也將對(duì)奶牛的躺臥及健康造成不利影響[20]。研究結(jié)果BRU處理后的RMS不適合直接作為墊料使用，可以通過對(duì)處理的RMS中添加一定量益生菌(乳酸菌，枯草芽孢菌，酵母菌等)并且給與一定時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵制作成為發(fā)酵床后使用將能夠降低可能的風(fēng)險(xiǎn)[21]。

4 結(jié) 論

牛糞經(jīng)BRU系統(tǒng)發(fā)酵16～18 h后能夠顯著降低再生固體牛糞墊料中的細(xì)菌數(shù)量、豐度、多樣性并且改變?nèi)郝浣M成，表現(xiàn)在細(xì)菌OTU數(shù)量上減少了57.73%，細(xì)菌豐富度指數(shù)(ACE指數(shù))降低了57.47%，香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)降低了81.63%，細(xì)菌和大腸桿菌數(shù)量顯著下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，金黃色葡萄球菌數(shù)量下降不顯著。再生固體牛糞墊料堆放30 d后金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著下降，BRU需要進(jìn)一步提高發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間，且處理后的RMS不能立即使用，其需要堆放30 d以上，待病原菌數(shù)量完全殺滅后，才可以被安全使用。