施用生物菌劑對棉田土壤細菌群落多樣性及種群結構的影響

劉海洋，王 偉，張仁福，雷 斌，姚 舉

(1. 新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆農業科學院核技術生物技術研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆棉花種植面積占全國80%以上，長年連作會導致棉花根腐病、黃萎病等土傳病害發生[1]。目前主要通過種植抗病品種防控土傳病害，由于抗性種質資源缺乏以及病原菌致病力變異復雜，致使棉花品種抗病性容易喪失，增加了土傳病害的防治難度。生物防治技術具有生態、無毒、促生、抑菌等優點，是目前防治棉花作物土傳病害的研究熱點。【前人研究進展】馬平等從棉花根際分離到一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)NCD-2，由該菌株研制的生物菌劑多年田間防治棉花黃萎病效果達70%以上[2,3]。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)X-278[4]、B.axarquiensisTUBP1[5]、B.malacitensisZ-5[6]、甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)LW-4[7]、死谷芽孢桿菌(B.vallismortis)HJ-5[8]等多株棉花病害拮抗菌株被挖掘出來，其中死谷芽孢桿菌HJ-5與有機肥合用對棉花黃萎病防效較好，并對土壤微生物區系有改善作用。研究表明，土壤微生物多樣性與土傳病害防治效果存在相關，調控土壤微生物群落結構或改變微生物功能多樣性對土傳病害有積極作用[9,10]。土壤細菌多樣性受土壤類型、作物種類、種植模式等多種因素以及各因素復雜相互作用的影響顯著[11-13]。【本研究切入點】土壤中的細菌群落及其結構變化能反映土壤生態環境的變化趨勢，雖然目前防治棉花土傳病害的生防菌株較多，但是缺乏商品化生產且大面積推廣應用的防治棉花土傳病害的生物菌劑，尤其關于生物菌劑施用后對土壤細菌群落多樣性影響的研究較少。研究生物菌劑對棉田土壤細菌群落多樣性及種群結構的影響。【擬解決的關鍵問題】研究新疆棉田施用以及減施化肥后土壤的微生物多樣性和群落結構變化，分析該生物菌劑對新疆棉田土壤微生物多樣性、種群結構的影響，以及其對土壤環境的改善作用，為提高棉花土傳病害的生物防治水平和化肥減施技術理論提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌劑

供試抗重茬微生態菌劑(下稱生物菌劑)由中農綠康(北京)生物技術有限公司生產提供，選用防病促生芽孢桿菌等高效菌株加工制備而成，有效活菌數≥5.0×108/mL。

1.1.2 土壤樣品

2017～2019年在新疆農業科學院庫爾勒農業有害生物防治野外科學觀測試驗站(E:85.807691，N:41.751360，下稱試驗站)分別采集施用生物菌劑棉田10～20 cm耕層的土壤，并采集相鄰棉田或分割棉田土壤作為對照，備用。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

(1)2017年土壤樣品采集

2017年7月4日在試驗站棉花黃萎病病圃內設生物菌劑和清水對照2個處理，每處理隨機排布3個小區，每個小區面積10 m2，試驗前分別對2個處理(B-Biofer、B-ck)取樣各3份，-80℃冰箱保存。于7月4日、7月14日、7月24日施用200倍菌劑3次，對照施用同量清水。于8月29日施用菌劑35 d后再分別對2個處理(Biofer、CK)各取樣3份，-80℃冰箱保存，與試驗前取的土壤樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進行高通量測序分析。

(2)2018年土壤樣品采集

2018年在試驗站內選擇單塊面積約15 000 m2棉田滴施生物菌劑(Biofer)，以相鄰正常管理棉田為對照(CK)，6月15日隨水滴施菌劑5 L/667m2，不施頭水肥；對照棉田滴施頭水肥(5 kg尿素，2 kg復合肥，2 kg黃腐酸)，于7月15日采集2個處理棉田土壤各5份，送北京百邁客生物科技有限公司進行高通量測序分析。

(3)2019年土壤樣品采集

2019年在試驗站內分別選擇1號、2號2塊棉田進行菌劑大田試驗。

1號棉田面積約30 000 m2，6月18日隨水滴施菌劑5 L/667 m2(Biofer1)，不施頭水肥；以相鄰正常管理棉田為對照(CK1，5 kg尿素，2 kg復合肥，2 kg黃腐酸)，于7月15日采集2個處理棉田土壤各5份。

2號棉田面積約30 000 m2，從棉田中間劃分為滴施菌劑(Biofer2)和正常管理對照(CK2， 5 kg尿素，2 kg復合肥，2 kg黃腐酸)2個處理，6月18日、6月26日隨水滴施菌劑2次，每667 m2滴施2.5 L/次，不施頭水肥；于7月18日采集每個處理棉田土壤各5份，與1號棉田采集土樣一起化驗土壤養分和理化性質，并送北京百邁客生物科技有限公司進行高通量測序分析。

1.2.2 土壤理化性質測定

檢驗2019年試驗站內采集的1號、2號2塊棉田及對照棉田土壤理化性質。每塊棉田5點土樣混合成1份土樣。將處理好的土壤樣品送交新疆土肥水農業科技工程中心進行統一分析化驗，指標包括pH值、總鹽、有機質、全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效磷、速效鉀。

1.2.3 土壤總DNA提取與文庫構建、測序

利用北京百泰克生物技術公司生產的DP4001土壤試劑盒提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量，使用Nano Drop 2000 UV-Vis光譜儀測定DNA濃度，總量滿足3次及以上建庫要求。所用引物為細菌16S rDNA (V3+V4)區域引物，338F：5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR擴增程序：98℃預變性2 min；98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個循環；72℃延伸5 min。由北京百邁客生物科技有限公司構建DNA文庫，采用Illumina Hiseq 2500 PE250模式進行測序。

1.3 數據處理

對測序獲得的原始數據使用FLASH V1.2.7軟件對每個樣品的序列進行拼接得到原始序列，用Trimmomatic軟件過濾質控后長度小于標簽長度75%的標簽，使用UCHIME軟件去除嵌合體得到高質量的序列。在相似性97%的水平上使用UCLUST軟件對序列進行聚類。在細菌16S Silva數據庫進行比對，在置信度閾值為0.8利用RDP Classifier軟件進行物種注釋分類。利用Mothur version V.1.30軟件進行Alpha多樣性指數分析，包括ACE指數、Chao1指數、香農-威納指數；基于Bray curtis多種算法呈現物種多樣性矩陣，進行Beta多樣性分析(n≥3)。利用LEfSe分析方法設定顯著差異的LDA值為4.0，尋找組間豐度差異顯著物種。

利用Excel軟件對常規數據進行整理、匯總，利用SPSS19.0軟件的ANOVA程序中的Duncan程序對數據進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 施用生物菌肥對棉田土壤理化性質的影響

研究表明，庫爾勒試驗站棉田土壤偏強堿性，2019年試驗站Biofer1、Biofer2棉田僅施生物菌劑而停施頭水肥使土壤總鹽、全氮、有機質、速效磷、速效鉀等指標均下降，其中全氮、有機質、速效鉀分別較對照降低28.7%、27.5%和31.9%，下降幅度較大；全磷、速效氮含量與對照田相比沒有下降，其中全磷、速效氮在1號棉田含量較其對照田分別高0.28 g/kg和3.0 mg/kg；全鉀在Biofer2棉田中含量高于其對照，在Biofer1棉田中略低于其對照，均無顯著差異。表1

表1 2019年試驗田土壤養分與理化性質Table 1 Soil nutrients and physicochemical properties of the experimental plots in 2019

2.2 施用生物菌劑棉田土壤細菌多樣性指數的影響

研究表明，2017年小區內生物菌劑施用前土壤細菌多樣性接近，無顯著差異，施用后土壤細菌多樣性變化趨勢一致但仍無顯著差異，但Shannon多樣性指數由低于對照轉為高于對照。2018年大田施用生物菌劑且停施頭水肥后，土壤中細菌的ACE、Chaol指數均低于對照，而Shannon多樣性指數略高于對照，處理間未達顯著差異。2019年大田試驗1、2號棉田土壤細菌多樣性指數與2018年趨勢一致，ACE、Chaol指數均顯著(P<0.05)低于對照，而Shannon多樣性指數略高于對照。停施頭水肥顯著降低了土壤細菌的豐富度，而施用生物菌劑則增加了土壤細菌的多樣性，但影響不顯著。表2

表2 生物菌劑不同年份施用后棉田土壤細菌多樣性指數Table 2 Diversity index of soil bacteria in cotton field after applying biofilm in different years

2.3 不同處理棉田土壤細菌群落聚類

研究表明，2017年小區試驗前土壤樣品B-CK1、B-CK2、B-Bio3、B-Bio2、B-CK3、B-Bio1交互聚為一支，細菌群落結構相似性較高；施用菌劑后處理Bio1、Bio2、Bio3單獨聚為一個亞枝，與清水對照CK組土壤細菌群落結構差異變大(圖1a)，施用菌劑在一定程度上影響了土壤細菌群落結構。2018年、2019年施用生物菌劑處理與相鄰常規管理對照棉田土壤細菌群落組成差異較大(圖1b、圖1c)，而2019年同一棉田分割而成的施用菌劑與常規管理2個處理各樣品交互聚類到一起，土壤的細菌群落組成相似性較高(圖1d)，施用生物菌劑對土壤細菌群落結構的影響較小；不同棉田的土壤背景差異可能是造成生物菌劑處理與相鄰常規管理對照棉田土壤細菌群落差異較大的原因。圖1

注：a:2017年試驗站病圃各處理土壤；b:2018年試驗站各處理土壤；c：2019年試驗站1號棉田各處理土壤；d：2019年試驗站2號棉田各處理土壤

2.4 不同處理棉田土壤細菌群落的組間差異

研究表明，當LDA值≥4.0時，2017年小區試驗菌劑處理Biofer與清水對照存在5個顯著差異標記，其中Biofer組中芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)顯著高于CK組，而CK組中厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)顯著高于Biofer組。2018年大田試驗CK組中變形菌門(Proteobacteria)顯著高于Biofer組(2018)，而Biofer組(2018)中沒有顯著差異標記。2019年大田試驗中Biofer1與CK1、Biofer2與CK2之間均沒有顯著差標記菌株，施用生物菌劑未顯著改變土壤細菌群落結構。圖2

注：a:2017庫爾勒棉花病圃各處理土壤；b:2018年試驗站各處理棉田土壤；c：2019年試驗站1號棉田各處理土壤；d：2019年試驗站2號棉田各處理土壤

2.5 不同處理棉田土壤拮抗細菌屬的豐度

研究表明，2017年小區試驗前土壤中芽孢桿菌屬(Bacillus)豐度為0.1%～0.12%，菌劑處理后，相對于清水對照(0.15%)菌劑處理土壤中芽孢桿菌屬的豐度(0.21%)由試驗前低于對照變為高于對照。2018年Biofer處理土壤中芽孢桿菌屬的豐度為1.72%，較其對照(1.30%)高0.42個百分點。2019年Biofer1處理土壤中芽孢桿菌屬的豐度為2.78%，較其對照(1.01%)高1.77個百分點；Biofer2處理土壤中芽孢桿菌屬的豐度為3.43%，已成為土壤中的優勢均屬，較其對照(2.48%)高0.95個百分點。

鏈霉菌屬(Streptomyces)的豐度在Biofer(0.48%)與CK(0.44%)處理之間以及Biofer1(0.20%)與CK1(0.18%)處理之間均相差不大，在Biofer(0.74%，2018)處理中豐度低于CK(1.22%，2018)，而在Biofer2(0.15%)的豐度是CK2(0.06%)的2.5倍。

溶桿菌屬(Lysobacter)的豐度在Biofer(0.28%，2017)和CK(0.27%，2017)處理之間、Biofer(1.31%，2018)和CK(1.14%，2018)之間以及Biofer1(0.10%)與CK1(0.11%)處理之間均相差不大，但在Biofer2(0.60%)處理的豐度是CK2(0.05%)的12倍。

假單胞菌屬(Pseudomonas)在Biofer(0.37%，2017)與CK(0.40%，2017)處理之間、Biofer(1.64%，2018)處理與CK(2.59%，2018)之間、Biofer1(0.48%)處理與CK1(0.63%)之間以及Biofer2(0.83%)與CK2(0.87%)處理之間豐度值均相差不大。

芽孢桿菌屬的豐度在所有處理中均高于對照，而假單胞菌屬的豐度在所有處理中均低于對照，溶桿菌屬、鏈霉菌屬在不同處理中無一致規律。表3

表3 4種主要細菌種群在不同處理土壤中的豐度值Table 3 Abundance values of 4 major bacterial populations in soils of different treatments

3 討 論

研究認為，有機施肥、生物菌劑通過有效菌株在土壤、作物根表、根際、體內定植后繁殖和轉移，發揮菌株的固氮、解磷、抗病、改良土壤等功能，其在定植、繁殖過程中會對土壤微生物群落產生影響[14]。研究發現施用生物菌劑而停施頭水肥后土壤中全氮、有機質、速效鉀含量下降幅度較大，但是全磷、速效氮含量沒有下降，土壤肥力表現出一定程度的盈余，后期可根據土壤中肥力指標變化程度制訂準確的減肥措施。此外，施用生物菌劑、停施頭水肥后土壤細菌的豐富度顯著降低，而細菌的多樣性一定程度上增加了，但是并不顯著。土壤pH值、電導率以及堿解氮、有效磷含量等多種因素與土壤細菌群落結構的變化有關[15-16]，可能由于化肥減量造成部分土壤理化性質指標降低影響了土壤中細菌的豐度；但是高量施氮亦會導致土壤次生鹽堿化和酸化，降低土壤細菌系統類型豐富度和系統發育多樣性[17]，適量施肥尤為重要。生物菌劑在不減化肥情況下能夠一定程度上影響土壤微生物群落組成，在減施化肥的情況下，這種改變程度會降低，相鄰棉田群落結構差異大的原因可能主要受土壤來源因素影響，因為相鄰田塊不同的pH、電導率可能影響了土壤細菌群落結構和多樣性[18-19]。

生物菌劑(生物肥、有機肥[20])通過增加土壤中有益菌群的豐度改善土壤微生物群落結構并達到防控土傳病害的目的。Sui等[21]用多粘類芽孢桿菌CP-S316發酵液處理楊樹后，其根際土壤中真菌的OTUs、Chao指數顯著降低，但是拮抗菌芽孢桿菌屬的比例較對照增加2.8個百分點，CP-S316改善了楊樹根際微生物群落結構。Li等[22]施用生物肥顯著增強了土壤微生物的酶活性以及芽孢桿菌、木霉菌、假單胞菌等拮抗細菌的豐度。Chen等[23]施用有機肥后花生根際細菌菌群的聚集抑制了鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發，對土壤抑制花生根腐病起關鍵作用，而化學施肥下潛在的真菌病原體在根際真菌菌群中占主導地位，促進了花生根腐病的發生。分析發現，施用生物菌劑且停施頭水肥與常規管理棉田土壤細菌種群之間顯著差標記較少，且2019年大田試驗發現沒有顯著差標記。土壤中拮抗菌群豐度的變化是研究關注的重點，研究中芽孢桿菌屬的豐度在施用生物菌劑土壤中均高于對照，呈現出逐年增加的趨勢，與Sui等[21]、Li等[22]部分研究結論一致。研究發現假單胞菌屬的豐度在所有的處理中均低于對照，溶桿菌屬、鏈霉菌屬的豐度在不同處理中無一致規律，并沒有隨施用生物菌劑而增高，與Li等[22]施用有機肥后木霉菌、假單胞菌等拮抗細菌升高不同，可能與生物肥、生物菌劑不同作用的機制所致。

部分生物菌劑對土壤微生物群落無明顯影響，Shin等[24]報道商品微生物菌劑EM-bokashi施用后未改變土壤細菌群落和多樣性，其認為EM中添加的微生物可能具有競爭性但不影響現有的細菌群落，EM并沒有持續抑制土壤傳播疾病或改變微生物活性、細菌組成和多樣性。Giotis等[25]也發現以枯草芽孢桿菌、寡雄腐霉和海藻提取物等為基礎的生物防治產品對土壤傳播疾病、土壤生物活性沒有積極影響。Lihua等[26]將生防菌株枯草芽孢桿菌B068150接種于壤土、沙土和粘土后沒有顯著改變3種土壤中黃瓜根際微生物群落的多樣性，尤其在粘土中B068150的種群密度與黃瓜根際細菌多樣性顯著負相關，其認為土壤類型可能參與了生物菌劑對微生物群落的調控。Larkin等[27]研究表明，商業和研究用的生物菌劑、微生物接種劑等雖然顯著影響土壤微生物群落特性，但影響效應低于輪作效應，某些輪作能夠更好地支持從改良劑中添加的有益菌群，使生物防治更有效，在改變土壤微生物群落特性方面，有利的作物輪作可能比改良劑更有效。研究中生物菌劑雖然在一定程度上增加了土壤中芽孢桿菌屬的豐度，但是未能顯著影響土壤細菌的群落結構，可能與土壤類型、作物種類、土壤理化性質、施用周期等因素有關，在新疆棉花單耕作系統中，持續施用生物菌劑有利于作物根際微生物保護層的形成，維持作物根際的健康。

4 結 論

棉田施用生物菌劑停施頭水肥后土壤全氮、有機質、速效鉀含量分別下降28.7%、27.5%和31.9%，下降幅度較大；而全磷、速效氮含量未下降；土壤細菌的豐富度(ACE、Chaol指數)顯著降低，Shannon多樣性無顯著變化。施用生物菌劑與常規管理棉田之間土壤細菌種群顯著差標記較少，對土壤細菌群落組成影響不顯著。土壤中有益菌芽孢桿菌屬的豐度呈現出逐年增加的趨勢，Biofer2處理升高38.3%；假單胞菌、溶桿菌、鏈霉菌等菌屬的豐度并未隨施用生物菌劑而增高。生物菌劑未能顯著影響土壤細菌的群落結構可能與土壤類型、土壤理化性質、生物菌劑施用技術等因素有關。