NaCl脅迫下不同銨、硝配比對小麥抗氧化酶活性的影響

喬 旭，高永紅，賽力汗·賽，薛麗華，張永強，陳傳信，肖 麗，雷鈞杰

(1.新疆農業科學院糧食作物研究所/農業部荒漠綠洲作物生理生態與耕作重點實驗室，烏魯木齊 830091；2.中國醫學科學院/北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；3.新疆農業科學院科研管理處，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】氮素是促進作物生長發育與產量形成中最重要的元素[1]。不同氮素形態與作物氮素營養生理特性及其生長發育有密切關系[1-3]。銨硝混合營養較單純的銨營養或硝營養更能獲得高產，如在大麥[4]、小麥[5]、棉花[6]、菠菜[7]、小白菜[8]等作物上的研究均證實銨硝混合營養優于單純的銨營養或硝營養。植物吸收同化每分子的銨態氮所消耗的能量低于等當量的硝態氮[2, 9]。【前人研究進展】鹽脅迫可使植物體內自由基積累量上升，產生大量活性氧化物，加強膜脂過氧化作用。丙二醛作為膜脂過氧化產物，通過破壞植物細胞膜的透性，影響植物各種生理代謝，對細胞造成損傷。但細胞中存在一系列的保護酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POX)、抗壞血酸過氧化物酶(APX) 和過氧化氫酶(CAT) 等，可在鹽脅迫時增強活性，加快對活性氧的清除，維持活性氧代謝平衡，保護膜的結構和功能[3, 5, 7]。銨硝混合營養對植物抵御逆境脅迫所造成的不利影響有顯著的促進作用，如水稻[3, 10]、大麥[4]、高羊茅[11]和番茄[1]等。【本研究切入點】關于鹽分(NaCl) 脅迫下不同氮素形態配比對小麥體內抗氧化酶活性的研究尚未見報道。土壤次生鹽漬化始終是威脅新疆綠洲農田土壤質量和限制作物產量的主要障礙因素。亟需研究鹽分脅迫下不同銨硝配比對小麥逆境生理特性的影響。【擬解決的關鍵問題】分析減輕鹽分脅迫對小麥幼苗傷害的可實現途徑，調控銨硝營養供給增強小麥幼苗在鹽分脅迫最敏感階段的抗性，促進小麥的早發，為鹽分脅迫與氮素營養互作機制的逆境生理學提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗在中國農業大學資源與環境學院溫室內進行。采用蛭石為介質的水培培養，微量元素參照Hammer et al. (1989)的方法配制，在營養液中加入占總氮量3%的硝化抑制劑 (Dicyandiamide, DCD)。供試小麥品種為新冬20號。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

設不同水平NaCl (0、100、200 mmol/L和NH4+/NO3-(0/100、25/75、50/50、75/25、100/0)，用總氮水平為5.0 mmol/L略加修改的Hoagland營養液，每個處理重復3次。播種之前選擇均勻、飽滿的種子曬種2 d，用10%的雙氧水對種子消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈。將種子播種在12 cm×12 cm的培養缽內，把培養缽置于長45 cm、寬33 cm、高20 cm的保險盒中，每個保險盒中放置12個培養缽，出苗以前用去離子水澆灌。當小麥出苗3 d后開始采用1/4濃度營養液培養3 d，然后換用1/2營養液培養3 d，9 d后用全營養液培養。出苗16 d后鹽分處理，每12 h增加50 mmol/L NaCl營養液培養幼苗，直到最終濃度為0、100和200 mmol/L。所有的營養液每3 d更換1次，每天用去離子水補充由于蒸發及蒸騰作用所損失的水分。在培養的過程中，用0.1 mmol/L的NaOH或HCl調節營養液pH值至5.8～6.0。

在鹽分處理73 d時每個重復分別取4個培養缽的小麥收獲，測定其生物量；取4個培養缽小麥的倒三葉和倒四葉，立即在液氮中速凍10 min，迅速轉移至-80℃超低溫冰箱中冷凍儲藏。

取樣：在鹽分處理55 d時，每個處理的每個重復隨機選定4株幼苗，取根系根尖吸干后測定根系活力。

1.2.2 測定指標

根系活力：稱取根尖樣品0.5 g，放入10 mL燒杯中，加入0.4% TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒在溶液內，在37℃下暗保溫1～3 h，此后加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反應。將根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂一起在研缽內磨碎，以提出甲月替。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌2、3次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10 mL，用分光光度計在波長485 nm下比色測定。

質膜透性：參考Tuna等[12]的方法。小麥倒三、倒四葉用去離子水清洗3次以去除葉片表面粘附的電解質，用直徑10 mm的打孔器避開主脈取樣，混合均勻，每個重復取6片放入50 mL三角瓶中，裝30 mL去離子水，25℃下在SHZ-82型恒溫振蕩器中振蕩24 h 后測定1次電導率(Lt)，然后煮沸20 min，用流動自來水迅速冷卻，然后立即測量各處理的煮后電導率(Lo)。

質膜透性(%)=Lt/Lo×100%。

酶液提取：稱取0.400～0.450 g葉樣，加入少許石英砂，1% PVPP (w/v%)，分次加入8 mL 50 mmol/L pH 6.8磷酸緩沖液于冰浴上研磨成均漿，10 000×g 4℃下離心20 min，上清液用于SOD、POX和APX活性的測定。

SOD活性：參照Meloni et al[13]的方法。3 mL的反應混合液中含50 mmol/L pH 7.8磷酸鈉緩沖液，2 μmol/L的核黃素，13 mmol/L甲硫氨酸，75 μmol/L氮藍四唑(NBT)，0.1 μmol/L EDTA，100 μL的粗酶液，在3 000 lx下光照10 min，測定560 nm下的OD值。以抑制NBT光還原50%的酶量作為一個酶單位。

POX活性：參照李合生[14]的方法。3 mL的反應混合液中含50 mmol/L pH 6.8磷酸緩沖液，20 mmol/L愈創木酚，20 mmol/L H2O2，100 μL的粗酶液，在30℃水浴中保溫3 min，測定480 nm下的OD值，每隔1 min讀數1次。以1 min OD480降低0.01為一個酶活單位，酶的比活力以Units/mg protein/min表示。

APX活性：參照Yazici et al[15]方法。1 mL的反應混合液中含50 mmol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液，0.5 mmol/L抗壞血酸，0.1 mmol/L EDTA Na2，1.0 mmol/L H2O2，100 μL的粗酶液，測定290 nm下單位時間內酶活性的變化。酶的比活力以Units/mg protein/min表示。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel，SigmaPlot和SPSS 16.0統計分析軟件進行處理, 處理間的差異顯著性采用Duncan進行單因素多重比較。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫和不同銨硝配比對小麥生物量的影響

研究表明，銨硝混合營養處理對小麥生物量具有顯著的影響 (P<0.05)，小麥生物量在純銨營養下最高，純硝營養下最低，不同銨硝營養處理對小麥生物量影響的表現效果順序NH4+/NO3-為100/0>75/25>50/50>25/75>0/100。在0、100和200 mmol 3個NaCl水平下，小麥生物量均表現為純銨營養處理 (NH4+/NO3-為100/0) 顯著高于純硝營養處理 (NH4+/NO3-為0/100) (P<0.05)。小麥生物量受鹽分脅迫影響均達到顯著水平 (P<0.05)。表1

表1 不同水平NaCl和不同水平NH4+/NO3-下小麥生物量變化 (g/株)Table 1 The effect of NaCl and NH4+/NO3- treatments on total dry weight of wheat seedlings(g/plant)

2.2 NaCl脅迫和不同銨硝配比對小麥根系活力的影響

研究表明，在鹽分脅迫和非鹽分脅迫條件下，隨著營養液中銨比例的增加小麥根系活力均顯著增大，在純銨營養下達到最大，NH4+/NO3-為100/0>75/25>50/50>25/75>0/100。鹽分脅迫明顯降低了小麥的根系活力，但增銨營養減輕了這種脅迫作用。一定比例的銨硝混合營養能提高根系活力，促進小麥的生長。圖1

注：圖中不同字母均表示在 (P<0.05) 水平上差異顯著，下同

2.3 NaCl脅迫和不同銨硝配比對小麥質膜透性的影響

研究表明，在0、100和200 mmol NaCl濃度下，銨硝混合營養 (NH4+/NO3-為75/25) 和純銨營養處理小麥葉片質膜透性明顯低于純硝營養處理。200 mmol NaCl濃度下，NH4+/NO3-為75/25和純銨營養處理的質膜透性分別比純硝營養處理低3.1%和3.6%。圖2

圖2 不同水平NaCl和不同水平NH4+/ NO3-下小麥質膜透性變化Fig.2 The effect of NaCl and NH4+/ NO3-treatments on electrolyte leakage of wheat seedlings

2.4 NaCl脅迫和不同銨硝配比對小麥保護酶活性的影響

研究表明，小麥葉片中的SOD和APX活性均隨著鹽分濃度的增加顯著降低；隨著銨比例的增加顯著增大，在純銨營養下達到最大值。0、100和200 mmol NaCl濃度下，純銨營養(NH4+/NO3-為100/0) 處理葉片SOD活性分別比純硝營養 (NH4+/NO3-為0/100) 處理高60.7%、104.8%和115.5%。

隨著鹽分濃度的增加小麥葉片POX活性顯著降低，而隨著銨比例的增加POX活性顯著增大，0、100和200 mmol/L NaCl濃度下，純銨營養 (NH4+/NO3-為100/0) 處理小麥葉片POX活性分別比純硝營養 (NH4+/NO3-為0/100) 處理高143.2%、130.7%和181.7%。圖3

圖3 不同水平NaCl和不同水平NH4+/ NO3-下小麥體內抗氧化酶活性變化Fig.3 The effect of NaCl and NH4+/ NO3-treatments on the antioxidative enzyme activities of wheat seedlings

3 討 論

雖然NH4+-N 和NO3--N 都能被植物迅速吸收，但所消耗的能量不同，植株吸收1分子的NO3--N 時消耗20份的ATP，而吸收NH4+-N 時只需消耗5份ATP，在根系中每吸收同化1分子的NH4+-N比NO3--N節約8%～12%，在莖稈中將節省3%～6%[2]。當使用混合態N 時，將會節省更多能量來抵御逆境脅迫所造成的不利影響，有益于植物在各種逆境生態條件下的生長。如董海榮等[6]和Meloni等[13]研究表明，銨硝混合營養優于單純的銨營養或硝營養。試驗表明，隨著營養液中NH4+-N比例的增加, 小麥總生物量呈增加的趨勢，與前人研究結果相似[5, 14-15]，在以硝態氮為主要氮源的旱地通過增銨營養對小麥苗期生長有促進效應。

在逆境脅迫下，植物依賴其體內存在的活性氧清除系統(保護酶系統和抗氧化劑系統) 之間相互協調來維持自由基生成與消除的動態平衡，但若脅迫強度超過“閾值”后，則會造成細胞內代謝失調，自由基逐漸積累，引起膜質過氧化作用加劇，造成質膜透性增大，導致細胞膜結構和功能的損傷[3-4]。試驗結果表明，相對于純硝營養，通過增銨營養在一定程度上能提高根系活力，從而減小膜脂過氧化作用，促進作物的生長，提高作物的抗逆境脅迫能力。在3個鹽分濃度梯度下，純銨營養處理小麥根系活力顯著高于純硝營養處理。

4 結 論

在鹽分脅迫和非鹽分脅迫條件下，相對于純硝營養，通過增銨營養在一定程度上能提高小麥根系活力，提高其抗氧化酶 (SOD、POX和APX) 活性，減輕鹽分脅迫所導致的細胞膜脂過氧化作用，提高植物的抗逆境脅迫能力。隨著鹽分濃度的增加小麥質膜透性顯著增大，而根系活力、SOD、POX和APX活性則隨著鹽分濃度的增加顯著降低 (P<0.05)。在鹽分脅迫條件下，銨硝混合營養 (NH4+/NO3-為75/25) 和純銨營養最有利于小麥的生長發育，可提高其抗逆境脅迫能力，減弱鹽分脅迫對小麥的傷害。