兩頭烏豬JAZF1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

楊 虎 ，徐興莉 ，饒榮海

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000；2.宜黃縣桃陂鎮(zhèn)獸醫(yī)站，江西 撫州 344400）

JAZF1（Ju xtaposed with another zinc finger gene1）基因又名Tip27，ZNF802，最早由全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的與人Ⅱ型糖尿病相關(guān)的基因，JAZF1基因?qū)游锾呛椭敬x有重要調(diào)控作用。盧春敏等將JAZF1基因轉(zhuǎn)染到小鼠肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)JAZF1基因過表達(dá)可以使SREBP1基因表達(dá)下調(diào)，而SREBP1基因表達(dá)產(chǎn)物是脂肪代謝調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控直接影響脂肪的合成。通過對小鼠研究發(fā)現(xiàn)，JAZF1基因過表達(dá)能夠顯著抑制肝臟的糖異生作用。這些研究表明JAZF1是體內(nèi)脂代謝和糖代謝的重要調(diào)控因子。JAZF1基因在動物體內(nèi)對脂肪代謝分子調(diào)控機(jī)制還不清楚，而脂肪含量特別是肌內(nèi)脂肪和肌間脂肪含量是評價動物肉質(zhì)的重要指標(biāo)。文章以肌內(nèi)脂肪含量適中的贛西兩頭烏豬為研究對象，克隆JAZF1基因的cDNA全長，并對該序列的組成、編碼蛋白質(zhì)的特點進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為探索JAZF1基因調(diào)控脂肪代謝機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

組織樣品取自贛西兩頭烏豬的背最長肌，且保存于-80 ℃，5'RACE和3'RACE克隆試劑盒分別購自Invitrogen公司和 Clontech 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA 合成

用反轉(zhuǎn)錄酶和特異性引物先合成cDNA第1鏈，然 后 用RNase Mix 對cDNA處理，最后再純化cDNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank提供的人JAZF1基因（登錄號：NM_175061）序列設(shè)計PCR引物（表1）擴(kuò)增并克隆測序，即可獲得JAZF1基因部分CDS（coding domain sequence）序列。

表1 引物序列

1.2.3 RACE擴(kuò)增

1）5'RACE擴(kuò)增。首先對純化后的cDNA末端加上多聚C，再用試劑盒特異性引物對已經(jīng)加尾的cDNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增；再用特異性引進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行并回收，最后將PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，并進(jìn)行測序，得到長度為684 bp的目的序列。2）3'RACE擴(kuò)增。 使用試劑盒特異引物及合成的cDNA進(jìn)PCR擴(kuò)增，電泳檢測并回收，純化后的PCR產(chǎn)物與載體連接并克隆測序，最終得到420 bp的序列。

1.3 統(tǒng)計分析

1.3.1 JAZF1基因的序列分析

根據(jù)克隆測序結(jié)果，利用軟件DNAstar7.1 預(yù)測JAZF1基因的ORF（Open Reading Frame）并預(yù)測氨基酸序列。

1.3.2 豬JAZF1基因的蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

分別預(yù)測JAZF1氨基酸的磷酸化位點（ http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、潛在的糖基化位點（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）及JAZF1蛋白的親水性（http://web.expasy.org/protscale/），利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

本實驗成功克隆了兩頭烏豬JAZF1基因部分CDS序列，利用RACE技術(shù)成功獲得了該基因的5'末端序列和3'末端序列。電泳檢測5'RACE和3'RACE的兩個產(chǎn)物片段，結(jié)果如圖1所示，兩頭烏豬部分CDS序列產(chǎn)物長為 620 bp（圖1A），5'RACE 產(chǎn)物長 684 bp（圖1B），3'RACE 產(chǎn)物長420 bp（圖1C）， 回收條帶并克隆測序。 最后得到了JAZF1基因的cDNA全長序列，共1 098 bp，包括ORF 732 bp，編碼243個氨基酸，氨基酸序列見圖2（DNASTAR）。

圖1 豬JAZF1基因 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 豬JAZF1核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列圖

2.1 豬JAZF1蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 蛋白理化性質(zhì)分析

豬JAZF1蛋白分子量為27 079.4 Da，等電點為8.63；JAZF1蛋白的氨基酸中，絲氨酸（Ser）含量為11.9%，所占比例最高，含量最低為蛋氨酸（Met），比例為2.1%。

2.1.2 JAZF1蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)

TMPRED分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，顯示豬JAZF1蛋白有1個跨膜結(jié)構(gòu)，且由內(nèi)向外，跨膜區(qū)的氨基酸殘基位置在8-25處,見圖3。

圖3 TMPRED軟件預(yù)測JAZF1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)

2.1.3 JAZF1潛在磷酸化位點和糖基化位點分析

在線分析JAZF1蛋白的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)2個蘇氨酸（Thr）、3個酪氨酸（Tyr）及18個絲氨酸（Ser）屬于蛋白激酶磷酸化位點（圖4）； 糖基化位點有19個（圖5）。

圖4 JAZF1蛋白磷酸化位點

圖5 JAZF1糖基化位點

2.1.4 JAZF1蛋白親疏水性分析

蛋白疏水性分析顯示，豬JAZF1基因編碼蛋白為水溶性蛋白，如圖6所示。JAZF1蛋白疏水性最小值為-2.700，,最大值為1.511，氨基酸序列內(nèi)大部分屬于親水性氨基酸。

圖6 JAZF1氨基酸親水性分析

2.1.5 蛋白結(jié)構(gòu)域分析及功能預(yù)測

結(jié)構(gòu)域顯示，豬JAZF1氨基酸殘基分別有3個 ZnF-C2H2 的結(jié)構(gòu)域；JAZF1蛋白功能分析結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)該蛋白在能量代謝、脂肪酸代謝的作用概率明顯高于其他功能，蛋白運載結(jié)合概率最高為2.030，說明JAZF1基因在脂肪酸代謝和轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用，可能對調(diào)節(jié)脂肪的沉積有重要影響。

表2 JZAF1蛋白功能預(yù)測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

JAZF1作為一個新發(fā)現(xiàn)的基因，其對糖代謝和脂肪代謝的重要調(diào)控作用已經(jīng)得到證實。糖代謝方面，JAZF1的表達(dá)與人的二型糖尿病密切相關(guān)，其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制目前尚不明晰。脂肪代謝方面主要是通過抑制脂肪形成和促進(jìn)其分解來調(diào)控，有研究證實，JAZF1主要是通過抑制細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸和甘油三酯的沉積，來提高肝臟脂肪酸的β氧化作用，進(jìn)而促進(jìn)脂肪分解。梁艷等研究發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的增加，JAZF1基因在豬肌肉中的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，研究結(jié)果顯示JAZF1基因在肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用；朱才業(yè)對不同品種羊全基因組關(guān)聯(lián)分析，證實JAZF1基因與脂肪形成密切相關(guān)。JAZF1的結(jié)構(gòu)域顯示該蛋白含有鋅指家族中最為普遍的C2H2結(jié)構(gòu)域類型，C2H2結(jié)構(gòu)域根據(jù)含鋅指結(jié)構(gòu)數(shù)量的多少可分為三類鋅指蛋白，含3個鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型鋅指蛋白（tC2H2），含多個C2H2結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白（maC2H2）；鋅指成對間隔排列的 spC2H2 型。豬的JAZF1蛋白結(jié)構(gòu)含有3個鋅指結(jié)構(gòu)，屬于tC2H2型鋅指蛋白，每個鋅指由一個螺旋和2個折疊組成，鋅指間由接頭連接，接頭內(nèi)氨基酸具有保守性，3個鋅指在蛋白內(nèi)串聯(lián)排列均結(jié)合到DNA大溝內(nèi)。此類結(jié)構(gòu)域通常作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與表達(dá)調(diào)控，所以JAZF1蛋白極有可能是參與肌內(nèi)脂肪沉積的重要調(diào)控因子。

蛋白質(zhì)磷酸化糖基化是最常見、最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，也是一種普遍的生命活動調(diào)節(jié)方式，在信號傳遞等過程中發(fā)揮重要作用。利用生物信息學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)JAZF1蛋白存在18個絲氨酸磷酸化位點，3個酪氨酸磷酸化位點，2個蘇氨酸磷酸化位點及19個糖基化位點， 這些位點可能在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化及細(xì)胞生長等多個生理過程中發(fā)揮著重要作用。JAZF1蛋白功能的預(yù)測表明該蛋白對脂肪酸代謝及能量代謝有重要的調(diào)節(jié)作用，JAZF1基因?qū)χ镜暮铣煽赡苡兄匾绊憽?/p>