口蹄疫滅活疫苗保存及穩(wěn)定性研究

劉國民，高日明，尚 策，宋慶慶，王 凱，陳炳全，朱修澤

（金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

口蹄疫滅活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S）是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、穩(wěn)定性決定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是無囊膜病毒，對氯仿不敏感，對溫度、酸堿度比較敏感，當pH變化或溫度升高時完整病毒146S容易分解。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果將大幅度降低，生產(chǎn)中如何保護146S抗原完整性又要保證疫苗純度，兩者關(guān)系是工藝攻關(guān)難點，完整病毒粒子配合優(yōu)質(zhì)佐劑，刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞，進而保護易感動物不被口蹄疫病毒感染，最終使口蹄疫滅活疫苗起到防控疫病的作用。

疫苗生產(chǎn)是系統(tǒng)工程，包括細胞培養(yǎng)、病毒放大生產(chǎn)、純化濃縮、分裝乳化、保存、使用等工序。臨床使用時，合格的疫苗必須具備安全、高效、均一、穩(wěn)定的特性；生產(chǎn)過程中采用合理的保存溫度和濃度，有助于延長病毒的保存期和維持較高的抗原水平，對生產(chǎn)中抗原的保存具有重要意義。本文通過對不同毒株熱穩(wěn)定實驗、半成品不同溫度、濃度下146S變化、同時通過成品疫苗保存期實驗及挑戰(zhàn)實驗等證明不同的口蹄疫毒株對溫度敏感性不同，半成品、成品疫苗對溫度、酸堿度比較敏感，2~8℃是成品疫苗最佳保存條件，希望本文研究結(jié)果對疫苗穩(wěn)定性方面研究，有一定指導(dǎo)作用。

1 材料

1.1 口蹄疫毒株病毒液

分別收集培養(yǎng)好的A/WH/09毒株液、O/MYA98毒株液、OR/80毒株液及OZK/93毒株液，各取1 000 mL備用。

1.2 口蹄疫半成品原液及濃縮液

A/WH/09、O/MYA98口蹄疫滅活半成品原液各1 000 mL，由金宇保靈公司生產(chǎn)部提供。

1.3 口蹄疫成品滅活疫苗

OA型口蹄疫滅活成品疫苗，數(shù)量20瓶由金宇保靈公司生產(chǎn)部提供。

1.4儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱、96孔板、培養(yǎng)瓶、DMEM營養(yǎng)液、微量濾器、凍存管、鋁制方箱，高壓鍋或水浴鍋等、206佐劑、超速冷凍離心機，紫外分光光度計，生物安全柜，玻璃容器，移液器等；2～8℃冰箱；-20℃冷凍冰箱；BHK21細胞。

2 方法

2.1 不同口蹄疫毒株熱穩(wěn)定性實驗

將A/WH/09毒株、O/MYA98毒株、OR/80毒株及OZK/93毒株病毒樣品，先進行批量解凍，將毒液分裝成10 mL離心管12只，將不同口蹄疫毒株在90℃熱水浴鍋中滅活1～8 min，檢測TCID50，并記錄數(shù)據(jù)，主要考察口蹄疫毒株對溫度的敏感性。

2.2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下146S影響實驗

隨機抽取本公司生產(chǎn)部滅活抗原液及其相應(yīng)批號的10倍濃縮純化液，分別取樣進行初始樣品146S含量的測定；將原液樣和10倍濃縮后樣液分裝，20 mL/瓶，每種樣品分2組，分別在-20℃和4℃冰箱中保存7個月，每月定期各取出1個樣品分別進行146S的測定。

2.3 口蹄疫成品滅活疫苗保存期試驗及反復(fù)凍融挑戰(zhàn)實驗

將同批次的20瓶OA型口蹄疫滅活成品疫苗分成2組，一組2～8℃保存12個月，每月抽檢一瓶；另一組做-20℃挑戰(zhàn)實驗，保存8瓶并反復(fù)凍融5次，凍融后檢測抗原含量。

3 結(jié)果

3.1 不同口蹄疫毒株熱穩(wěn)定性實驗

從表1、圖1數(shù)據(jù)分析可知：A/WH/09毒株的溫度穩(wěn)定值最低，說明A/WH/09毒株對溫度比較敏感，弱于其他毒株，而O/MYA98、OZK/93在90℃條件下裂解8 min后，檢測不到有效病毒，說明O/MYA98、OZK/93毒株比較穩(wěn)定。

圖1 不同口蹄疫毒株對90℃熱水浴穩(wěn)定性實驗

表1 90℃熱水浴對不同口蹄疫毒株的穩(wěn)定性實驗（TCID50）

3.2 口蹄疫半成品原液、濃縮液在4℃和-20℃條件下保存期實驗

從表2、圖2、圖3數(shù)據(jù)分析可知，口蹄疫半成品在4℃和-20℃保存的7個月中，完整病毒146S粒子的含量均有所下降。4℃保存條件下，原液樣和濃縮樣完整病毒146S粒子的降解分別為27.5%、12.3 %；-20℃保存條件下，其降解率分別為87.5%、92.4%。從本實驗數(shù)據(jù)證明，4℃比-20℃保存條件更有利于抗原的保存，濃度對抗原保存影響不顯著。

圖2 原液樣品1-7月146S變化曲線

圖3 濃縮后樣品1-7月146S變化曲線

表2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下對完整病毒146 S檢測結(jié)果 μg/mL

3.3口蹄疫成品疫苗2～8℃保存期實驗

從表3、圖4數(shù)據(jù)可知，口蹄疫 A 型、 O型滅活疫苗在2～8℃分別放置 12 個月，每月采用蔗糖密度梯度離心定量法檢測146S含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)146S抗原含量基本沒有變化,說明疫苗有效抗原保存比較好，完整病毒粒子保存完整。

圖4 口蹄疫滅活疫苗在2～8℃保存期實驗

表3 口蹄疫O型、A 型滅活疫苗保存期實驗

3.4 口蹄疫滅活疫苗反復(fù)凍融挑戰(zhàn)實驗

從表4、圖5數(shù)據(jù)可知，將口蹄疫滅活疫苗多次冷凍融化后，抗原含量降解比較多，每次反復(fù)凍融抗原損失10%～20%左右，5次反復(fù)凍融后，抗原損失50%左右，因此在保管疫苗時盡量不要凍融。凍融后的疫苗堅決不能使用，因為完整病毒粒子146S已經(jīng)裂解為無效的12S五聚體。

圖5 口蹄疫O型、A型滅活疫苗反復(fù)凍融后146s抗原含量變化(μg/mL)

表4 口蹄疫O型、A型滅活疫苗反復(fù)凍融后146S變化

4 討論

4.1 不同口蹄疫毒株熱穩(wěn)定性實驗

口蹄疫滅活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S粒子）是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、穩(wěn)定性決定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是無囊膜病毒，對氯仿不敏感，對溫度、酸堿度等物理、化學物質(zhì)比較敏感，如果保存不當、pH變化或溫度升高時，完整病毒146S容易分解為五聚體即12S。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果將大幅度降低，因此工藝控制及保護完整病毒粒子不降解是各個生產(chǎn)企業(yè)的絕密技術(shù)，如口蹄疫病毒的純化、濃縮、保存技術(shù)都是口蹄疫生產(chǎn)中很難突破的技術(shù)，生產(chǎn)中如何保護146S 抗原完整性又要保證疫苗純度，兩者關(guān)系是工藝攻關(guān)難點，完整病毒粒子配合優(yōu)質(zhì)佐劑，刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞，進而保護易感動物不被口蹄疫病毒感染，最終使口蹄疫滅活疫苗起到防控作用。

4.2 口蹄疫半成品原液、濃縮液在4℃和-20℃條件下保存期實驗

146S是指口蹄疫病毒在繁殖子代病毒過程中，由病毒衣殼和基因組共同組成的完整粒子，不是所有的抗原都能產(chǎn)生有效抗體，能刺激機體產(chǎn)生有效抗體的抗原才稱為有效抗原，口蹄疫完整病毒粒子在蔗糖密度梯度中的沉降系數(shù)為146S，所以我們就用146S來代表口蹄疫疫苗的有效抗原。目前146S評價方法有蔗糖密度梯度離心法、 紫外分光光度計定量法、液相色譜儀定量法、ELISA 檢測法等4種檢測方法，但蔗糖密度梯度離心法是OIE推薦的金標準檢測方法，大部分疫苗生產(chǎn)企業(yè)用此方法進行定量添加抗原，因為完整的 146S 抗原上有口蹄疫病毒的所有中和位點，能有效刺激動物機體產(chǎn)生抗體，因此完整的146S粒子的濃度多少，可作為一項評價口蹄疫疫苗質(zhì)量的標準。

4.3 口蹄疫疫苗抗原穩(wěn)定性與免疫原性的關(guān)系

穩(wěn)定的抗原、有效的佐劑是疫苗研究的重點和難點。滅活疫苗在長期儲存、加熱和微酸性環(huán)境中，病毒顆粒極其容易裂解，裂解產(chǎn)物也被稱為12S，12S是一個由VP1，VP2，VP3組成的五聚體。因為五聚體之間存在大量的組氨酸殘基，在酸性環(huán)境下組氨酸會迅速發(fā)生質(zhì)子化，釋放正電荷，通過靜電排斥作用引發(fā)粒子裂解，這正是口蹄疫疫苗不穩(wěn)定的原因。由于146S粒子在酸性環(huán)境下分解成12S 粒子，而12S表面的免疫反應(yīng)位點被隱藏或發(fā)生形變的緣故，使12S不具備任何免疫原性，無法激發(fā)機體產(chǎn)生抗體，降低了口蹄疫疫苗的免疫效力。口蹄疫病毒會在高溫狀態(tài)下，使組合狀態(tài)的 12S 粒子轉(zhuǎn)化為分解狀態(tài)，因此口蹄疫疫苗不宜長期暴露在高溫狀態(tài)下，口蹄疫疫苗效力與口蹄疫滅活疫苗中的 146S 粒子數(shù)量有關(guān)，若是能夠確保 146S 粒子穩(wěn)定不被分解，那么口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保護，這也是口蹄疫滅活疫苗需2～8℃保存的機理。口蹄疫抗原穩(wěn)定性差給口蹄疫疫苗的生產(chǎn)、儲存和應(yīng)用帶來了很多困難，使用過程中必須全程冷鏈運輸以保護口蹄疫疫苗的免疫原性。

4.4 口蹄疫疫苗抗原保護劑、儲存、運輸

口蹄疫病毒抗原對酸和熱極其敏感，為了保證疫苗質(zhì)量，生產(chǎn)商采取研發(fā)疫苗抗原保護劑，增加昂貴的冷鏈運輸系統(tǒng)，將優(yōu)質(zhì)疫苗送到用戶手中。如何保障疫苗抗原不降解或降解速率慢，是疫苗生產(chǎn)企業(yè)的難點，但金宇生物一直采用自主研發(fā)的UTM保護劑，從工藝技術(shù)上保障疫苗穩(wěn)定性，從運輸環(huán)節(jié)上采用無死角的2～8℃冷鏈運輸，使客戶用上最好、最新鮮的疫苗。不論后續(xù)口蹄疫疫苗技術(shù)如何革新，對口蹄疫病毒粒子的完整性和穩(wěn)定性研究，一直是廣大科技從業(yè)者長期努力和研究的方向。