阿爾茲海默病患者線粒體轉運RNA變異的初步研究

袁妮娜 章瑜 丁禹 冷建杭*

阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，AD），又稱老年癡呆癥，是一種神經退行性疾病，多發于老年或老年前期，85歲以上發病率最高，女性多于男性，預計至2050年世界上將有1.5億AD患者［1］。AD已成為繼心血管疾病、惡性腫瘤、中風之后的第4位死亡原因，目前其發病機制尚未完全闡明。有研究報道，β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）、神經纖維纏結以及線粒體功能障礙皆可導致AD的發病，而且三者可形成復雜的惡性循環，共同加重AD的發展［2-4］。線粒體基因組是雙鏈環狀DNA分子，全長16 569-bp，共包含37個基因，編碼13種蛋白質，22種tRNA與2種rRNA［5］。線粒體基因的排列十分緊密，除了D-loop外，相鄰的基因之間幾乎沒有任何非編碼區。由于線粒體缺乏組蛋白保護，直接暴露于氧化磷酸化的環境中，其變異率遠高于核基因［6］。本研究主要通過篩查AD患者的線粒體tRNA變異情況，探討線粒體tRNA變異與AD的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月至2020年6月在本院確診為AD的患者100例，作為觀察組。其中，男59例，女41例；年齡（75.3±4.2）歲；均符合2011年美國國立衰老研究院和阿爾茲海默病協會關于AD的診斷標準［7］和美國國立神經病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關疾病學會的AD診斷標準［8］；排除合并嚴重的肝腎疾病、嚴重感染、惡性腫瘤者。另選取同期在本院體檢的健康者50例作為對照組。其中，男35例，女15例；年齡（69.5±9.6）歲。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 線粒體tRNA變異篩選 抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血5 mL，使用酚-氯仿的方法提取基因組DNA，-30 ℃保存備用。以提取的全基因組DNA為模板，進行22個線粒體tRNA基因組的擴增，所需的引物參照本課題組前期發表的論文［9］。其中，PCR的條件為95 ℃變性5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環，最后72 ℃ 5 min作為延伸。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳分析后純化，并用Big Dye Terminator Cycle測序反應試劑盒處理，美國應用生物系統公司（Applied Biosystems，ABI）3700 DNA自動測序儀直接測序分析，所得的結果用DNA STAR軟件與人類線粒體DNA標準劍橋序列（GenBank No. NC_012920）進行比對［10］，篩選變異位點。同時，對50例健康對照個體進行線粒體tRNA基因的PCR擴增和測序，方法同上。

1.3 種系進化保守分析 使用人、鼠［11］、牛［12］和非洲爪蟾［13］等4個物種的線粒體DNA序列進行種系進化保守分析，然后在16個哺乳動物之間進行進一步的分析，計算保守性指數（conservation index，CI），以CI≥75%視為有功能學意義。

2 結果

2.1 AD相關的線粒體tRNA變異篩選 共發現了5個可能的致病性突變：tRNAIleA4263G，tRNAAlaT5655C，tRNACysT5802C，tRNAGluA14693G以及tRNAThrG15927A，見圖1。但是，這些突變在對照組中均未發現。其中，1例AD患者攜帶A4263G突變（1%），2例攜帶T5655C突變（2%），1例攜帶T5802C突變（1%），2例攜帶A14693G突變（2%），2例攜帶G15927A突變（2%）。

圖1 AD相關的線粒體tRNA變異位點

2.2 AD相關的線粒體tRNA變異特點分析 經過線粒體tRNA二級結構分析發現，在這些突變中有2個變異發生在線粒體tRNA接收臂上（tRNAIleA4263G和tRNAAlaT5655C），有2個變異發生在反密碼子環上（tRNACysT5802C和tRNAThrG15927A），有1個變異發生在TψC環（tRNAGluA14693G）。有3個突變破壞了原有的A-T堿基對（A4263G，T5655C和T5802C），1個突變破壞了原有的C-G堿基對（G15927A）。進一步的種系進化保守分析發現，這些突變在不同的物種之間都是高度保守的，提示具有功能學意義，見表1。

表1 AD有關的線粒體tRNA變異分析

3 討論

目前，全世界約有4700萬AD患者，65歲以上的老年人群中約有1/8患有AD，相關的醫療費用高達數十億美元。隨著人類平均壽命的不斷提高，AD對世界構成了巨大的公共衛生挑戰。

成年人大腦的比重雖只占2%，但消耗將近20%的氧氣，為滿足如此巨大的能量需求，大腦配置了巨大的線粒體容量，因此大腦正常功能極易受到線粒體功能障礙的影響，線粒體功能損傷在AD的發生發展中起著重要作用［14-16］。本研究對杭州地區的100例AD患者和50例健康對照個體進行了線粒體tRNA的全基因組突變篩查，結果提示AD患者的線粒體tRNA突變頻率高于健康對照組。在這些突變中，位于接收臂上的突變有兩個，分別為A4263G和T5655C。事實上，A4263G突變位于線粒體tRNAIle5’起始端，該位點的突變影響了tRNAIle的轉錄及RNase P 5’端的加工［17］。A4263G突變會顯著降低tRNAIle的穩定性和線粒體蛋白合成，表明A4263G突變可能會引起線粒體功能損傷。此外，線粒體T5655C突變位于線粒體tRNAAla的5’末端。功能學研究表明，該突變導致線粒體RNase P對tRNAAla前期5’端剪切效率下降30%，ATP水平顯著下降，而ROS水平明顯上升，表明T5655C突變可能引起線粒體功能障礙［18］。

同質性的T5802C突變則位于tRNACys基因的反密碼子環上，反密碼子環承擔著密碼子與反密碼子的相互作用以及氨基酸搬運工作［19］。從結構上看，線粒體T5802C變異破壞了原有高度保守的堿基對（30A-40G）。因此，有理由相信該突變會導致線粒體tRNA代謝障礙，進而導致線粒體蛋白合成受阻。此外，G15927A突變破壞了原有的高度保守的Watson-Crick堿基配對（28C-42G）。前期研究表明，G15927A突變導致線粒體tRNAThr的氨基酰化水平下降39%，嚴重影響了線粒體蛋白合成，尤其是線粒體ND1和CytB的表達［20］。

A14693G突變發生在tRNAGlu基因54位點上，該位點在進化上高度保守。與核基因編碼的tRNAs一樣，線粒體tRNA也要經過轉錄后修飾，在通常情況下tRNAGlu的54位的堿基常需要經過修飾才能維持tRNA的二級結構和功能的穩定性［21］。因此，A14693G變異可能會影響tRNAGlu的空間結構和功能穩定性，使tRNA的代謝功能障礙，引起線粒體功能損傷［22］。

綜上所述，線粒體tRNAIleA4263G，tRNAAlaT5655C，tRNACysT5802C，tRNAGluA14693G以及tRNAThrG15927A突變會影響線粒體tRNAs的代謝，導致線粒體蛋白合成受阻、功能損傷，進而參與AD的發病進程。由于本研究的樣本量較少，后續還需擴大樣本量來進行進一步研究。