谷氨酸、γ-氨基丁酸在偏頭痛模型PAG和TNC中的變化

張先元 張路平 陳強 嚴民力 周會霞 曹志堅 章正祥*

偏頭痛是一種以單側搏動性疼痛為主的頭痛病，常常反復發作，嚴重影響生活。其發病機制尚不明確，可能與腦干下行疼痛調節系統有關，該系統包括中腦導水管周圍灰質（periaqueductal gray，PAG）、三叉神經脊束核尾側亞核（caudal spinal trigeminal nucleus，TNC）等［1］。偏頭痛發作間期進行磁共振彌散張量成像，發現三叉神經脊束核和PAG表現出更大的平均擴散率［2］，磁共振波譜發現谷氨酸（glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）存在異常［3］。Glu、GABA分別是神經系統主要的興奮性神經遞質和抑制性神經遞質，兩者之間調節異常可引起慢性疼痛［4］。本研究旨在探討偏頭痛模型PAG和TNC中的Glu及GABA變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級別SD雄性大鼠30只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016，動物合格證編號：2008001670602。分籠飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，自由取食、飲水。本實驗經浙江中醫藥大學動物實驗研究中心批準（動物實驗設施使用許可證編號：2016143），動物實驗條件合格證號：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 藥物與試劑 硝酸甘油（批號：20150814，北京益民藥業有限公司）；重水（批號：MKBW4494V，美國Aldrich公司）；利扎曲普坦（批號：20160419，湖北歐力制藥有限公司）；甲醛溶液（批號：20170412，上海凌峰化學試劑有限公司。

1.3 實驗器材 冰凍切片機（型號：HM 550 VPD，美國Thermo SCIENTIFIC公司）；600 M核磁共振波譜儀（型號：600 MHz/AVANCE HD，瑞士BRUKER公司）；5 MM核磁管（型號：WG-1000-7，美國WILMAD公司）。

1.4 實驗方法 （1）分組、給藥與造模：30只大鼠采用Excel軟件完全隨機設計的分組方法分為對照組、模型組和西藥組，每組各10只。對照組、模型組灌胃超純水，西藥組灌胃利扎曲普坦（溶于超純水配成0.102 mg/mL濃度），給藥劑量1 mL/100 g，每日上午1次，連續灌胃7天。在第7天灌胃結束后，于透明鋼化玻璃箱（30 cm×30 cm×40 cm）中適應0.5 h，然后于上午9：30～10：00進行造模，對照組腹腔注射生理鹽水，模型組、西藥組腹腔注射濃度5 mg/mL硝酸甘油，給藥劑量0.2 mL/100 g。（2）行為學錄制與福爾馬林實驗：腹腔注射藥物5 min后，于玻璃箱中觀察大鼠的行為學表現，保持周圍環境安靜，用高清攝像機錄制4 h行為學視頻。行為學錄制結束后，在大鼠左后爪的中間跖區域皮下注射100 μL的1%福爾馬林（甲醛稀釋于0.9%生理鹽水），注射完成后立即放入鐵架上的玻璃箱中，通過下方45°斜放的鏡面反射大鼠足部動作，用攝像機錄制大鼠足部行為1.5 h。（3）取PAG與TNC：足部行為錄制結束后，予各組大鼠1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g麻醉。取出腦組織，在低溫環境下分離出腦干，放入液氮中運輸至實驗室，再將腦干置于-20 ℃的冰凍切片機上，根據《大鼠腦立體定位圖譜》（第6版）進行特定核團的定位，進一步分離出PAG與TNC，所有組織存于-80 ℃冰箱。（4）核磁共振波譜代謝組學：①取出TNC和PAG用電子天平稱重并記錄；②樣品放入含有600μL 0.05% TSP-d4重水的研磨管中研磨，隨后轉移至直徑5 mm的專用核磁管中；③采用Bruker AVANCE ⅢTM 600 MHz（14.09T）核磁共振波譜儀主機，配備5 mm-BBFO探頭，D2O鎖場，自動勻場后，采用noesypr1d序列獲得壓水峰圖譜，獲取時間1.7 s，采集次數128次，數據點32 K，掃描時間約8.9 min；④測量的代謝物包括肌酸（Cr）、GABA、Glu，采用Bruker Topspin 3.2獲取原始數據；⑤利用波譜分析處理軟件MestRe Nove處理FID文件，進行傅里葉變換、相位校正和基線校正，以三甲基硅烷丙酸酯（TSP）為內標，TSP化學位移為0.00 ppm；⑥計算相關代謝物絕對濃度：CM=AM/ATSP*fP*CTSP*MWM/WM，再進一步校正TSP和重量因素，絕對濃度=CM/TSP/體重，表示為cGABA、cGlu；⑦計算代謝物相對濃度：相關代謝物絕對濃度與Cr的比率視為相對濃度，表示為rGABA、rGlu。1.5 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素設計方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；不符合正態分布以［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H法，兩兩比較采用all pairwise。采用廣義線性混合效應模型分析不同部位腦代謝產物的區別。根據數據分布特點，cGlu光譜數值取lg值，表示為lg（cGlu）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組的腦代謝產物比較 對照組RTNC一個樣本丟失，一個樣本數據圖形差，所以只有8個樣本可進行分析。PAG內rGlu的組間比較差異有統計學意義（P=0.034），模型組較生理鹽水組減少（P=0.031），西藥組與模型組比較有增多趨勢，但差異無統計學意義（P=0.288），其余腦代謝物質值組間比較均無統計學差異（P＞0.05）。見表1～4。

表1 三組的cGABA值比較

表2 三組的cGlu值比較

表3 三組的rGABA值比較

表4 三組的rGlu值比較

2.2 腦代謝產物在不同部位的區別 對cGABA、cGlu、rGABA、rGlu進行廣義線性混合效應模型分析。cGABA組間無統計學差異（F=0.252，P=0.778），部位之間有統計學差異（F=136.459，P＜0.001）；與RTNC的cGABA（Coefficient=0）相比，PAG的cGABA值更高，差別有統計學意義（PAG Coefficient=0.261，tPAG=12.483，P＜0.001），而LTNC的cGABA值無統計學差異（LTNC Coefficient=-0.026，tLTNC=-1.410，P=0.162）。cGlu組間無統計學差異（F=0.095，P=0.910），部位之間有統計學差異（F=32.118，P＜0.001）；與RTNC的cGlu（Coefficient=0）相比，PAG的cGlu值更高，差異有統 計 學 意 義（PAG Coefficient=0.146，tPAG=6.762，P＜0.001），而LTNC的cGlu值無統計學差異（LTNC Coefficient=-0.016，tLTNC=-0.644，P=0.522）。rGABA組別與部位有交互效應（F=2.957，P=0.025），單獨分析各個部位的組間差異，結果顯示PAG、RTNC、LTNC的組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。rGlu組間無統計學差異（F=2.117，P=0.127），部位之間有統計學差異（F=3.798，P=0.026）；與RTNC的rGlu（Coefficient=0）相比，PAG的rGlu值更高，差別有統計學意義（Coefficient=0.040，tPAG=2.736，P=0.008），LTNC的rGlu值無統計學差異（Coefficient=0.016，tLTNC=0.905，P=0.368）。

3 討論

Glu和GABA是偏頭痛的重要神經遞質，與頭痛的發生與終止密切相關［5］。TNC和PAG是偏頭痛的重要疼痛結構。本研究模型組PAG的Glu較對照組減少，而GABA無明顯變化，因此重點圍繞Glu進行討論。

PAG是疼痛調節的關鍵結構［6］，主要負責疼痛感知的下行調節［7］。PAG-中縫大核回路是偏頭痛主要的下行疼痛調節通路。PAG通過Glu激活中縫核，中縫核激活腦啡肽神經元，從而抑制C纖維疼痛信號傳入［7］。中縫大核將下行纖維投射到TNC。研究發現，偏頭痛大鼠模型中PAG、中縫大核和TNC內的c-Fos陽性細胞數顯著增加，實驗結果可見PAG被激活的細胞數較TNC多［8］。本研究發現，PAG的Glu含量較TNC多，提示PAG在偏頭痛中扮演著更重要的角色。有研究發現，若腹外側PAG的谷氨酸能神經元通過化學遺傳操作被激活，可抑制傷害感受，但不是所有腹外側PAG 的谷氨酸能神經元亞群都有鎮痛作用，和此作用相關的是投射到延髓頭端腹內側區（RVM）的亞群［9］。2020年，HOSSEINI等發現PAG中代謝型谷氨酸受體亞型8的活化通過調節RVM off細胞活性來改善痛閾。從以上研究可見，谷氨酸是PAG調節疼痛的重要神經遞質。2005年，ISHIDE等發現對大鼠后肢進行機械刺激可激活C纖維，使PAG內的Glu增加，進一步研究發現L-精氨酸滲入PAG雙側后，會使機械刺激誘導的Glu釋放減少。本研究對大鼠腹腔注射硝酸甘油后，用福爾馬林對足部進行疼痛刺激，結果發現PAG的Glu釋放減少。這兩個研究有一個共同點，即一氧化氮（nitric oxide，NO）在其中發揮介導作用。NO在體內主要來自于精氨酸［10］，硝酸甘油也是NO的供體［11］，NO升高可誘發偏頭痛，使用硝酸甘油制備偏頭痛模型是經典的造模方法。大鼠注射硝酸甘油后，在體內轉化生成NO，進而作用于PAG，使福爾馬林誘導的Glu釋放減少，進一步導致PAG內Glu的鎮痛作用減弱［12］，因為Glu可誘導神經元一氧化氮合酶釋放NO［13］，本研究結果還提示NO和Glu之間可能存在負反饋調節機制。利扎曲普坦是臨床上用于治療偏頭痛的5-HT 1B / D受體激動劑，雖然西藥組PAG內的Glu和模型組比較無統計學差異，但也存在升高趨勢，可能與5-HT 1B / D受體激動劑可以降低大鼠腦中NO含量的作用有關［10］。TNC是三叉神經通路的二級傷害感受神經元。偏頭痛的發作最有可能起源于下丘腦，并激活TNC［14］。1987年，MAGNUSSON等發現谷氨酸能三叉神經丘腦投射神經元主要分布在三叉神經感覺主核，三叉神經脊束極間亞核，而在TNC分布較少。2006年，OSHINSKY等研究發現TNC細胞外Glu增加的時間過程與大鼠面部感覺閾值的變化有關。2014年，OSHINSKY等在慢性三叉神經痛大鼠模型上腹腔注射硝酸甘油后，發現TNC上的Glu明顯增加。也有研究顯示，通過注射硝酸甘油獲得偏頭痛模型的面部疼痛閾值無明顯變化［15］。本研究發現，偏頭痛模型TNC上的Glu無明顯變化，可能是因為造模后面部疼痛閾值無變化，并且本研究未對大鼠面部進行任何疼痛刺激。結合既往研究認為，TNC的Glu主要參與面部疼痛的調控。

綜上所述，PAG在偏頭痛中發揮著重要作用，硝酸甘油可能通過NO影響PAG內Glu的釋放，進而影響對疼痛的反應，為偏頭痛患者鎮痛能力減弱的現象提供了一種解釋［16］，下一步將會進行NO如何調控PAG的Glu的研究。本研究PAG與TNC的GABA絕對濃度不同，但相對濃度無差異，雖然這兩個部位的GABA未受到硝酸甘油明顯影響，但是GABA和疼痛密切相關，還需進一步完善GABA在其他偏頭痛相關結構中的研究。