HPV18融合轉錄本E1/CCAT1在宮頸癌篩查中的應用

魯偉 姚軼敏 李強

HPV感染與宮頸癌及癌前病變的發生發展密切相關，而高危型HPV病毒整合入宿主細胞是細胞轉化及癌變的關鍵［1-3］。迄今為止，共有超過250個HPV-host整合位點被報道［4］。隨著二代測序及生物信息學的發展，研究發現HPV-host整合后可產生大量的HPV-host融合基因，并進一步轉錄形成新的融合轉錄本［5，6-8］。

HPV病毒感染與宿主基因組發生整合產生的轉錄本（序列）在癌癥的診斷治療中具有一定意義［5］。HPV18作為HPV高危型病毒，與宮頸癌的發生發展密切相關，Hela細胞系是一類攜帶了HPV18病毒的細胞株，通過檢測HPV18宿主基因的融合轉錄本，有可能為HPV18相關宮頸癌的診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月至2020年3月于本院行宮頸活檢或手術治療的HPV感染患者62例。其中，宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ21例，CINⅡ/Ⅲ共28例，宮頸癌（cervical carcinoma，CC）13例；年齡35～57歲，中位年齡為46歲。收集62例HPV感染患者經陰道鏡活檢、錐切術或手術切除的部分宮頸組織，-70 ℃液氮保存，將因宮頸良性病變行全子宮切除的非HPV18感染患者作為對照組。另收集同期門診或體檢進行宮頸癌篩查的女性105例，年齡22～65歲，平均41歲。所有患者均經上海透景生命科技股份有限公司HPV核酸分型確定為HPV18感染。

1.2 細胞株培養 人正常宮頸細胞及宮頸癌細胞系Hela（HPV18陽性）購自美國典藏培養中心，置于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。

1.3 HPV與人融合基因的引物合成 通過檢索Pubmed SRA數據庫，篩選出HPV18陽性的宮頸上皮細胞的RNA-SEQ數據（SRR2185953）。利用生物信息學方法（Fusion-finder）［9］從HPV18陽性的宮頸上皮細胞的RNA-seq的數據中篩選出可能存在的HPV18病毒-宿主基因融合轉錄本。采用PCR等方法對其在HeLa細胞株、臨床宮頸組織和上皮細胞標本進行驗證。共篩選出16個可能存在的HPV-host融合轉錄本，針對融合轉錄本的基因融合區域設計引物，部分轉錄本因序列過短未進行驗證，共設計驗證10對引物，引物由上海生工合成，見圖1和表1。

表1 HPV18與宿主產生的融合轉錄本及引物信息

圖1 E1/CCAT1融合轉錄本（非編碼RNA）產生示意圖

1.4 Hela細胞、宮頸上皮細胞、癌組織基因相對表達量檢測 收獲培養細胞1～5×107，移入1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol，混勻，室溫靜置5 min；取50～100 mg宮頸組織或1 mL宮頸刷取物置1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol 充分勻漿，室溫靜置5 min。采用核酸提取試劑盒（磁珠法，上海之江生物公司）提取所有標本總RNA，具體操作步驟按試劑說明書進行。再利用已經設計好的針對HPV與人融合基因的引物，用TaKaRa公司PCR試劑盒在cobasZ480擴增儀上逆轉錄并擴增，E1/CCAT1基因上游引物：5′-GGTTCATGTCTCGGCACCTT-3′，下游引物：5′-GGTGTGCATCCCAGCAGTAA-3′。C-MYC基因上游引物：5′- ATTTGAGGCAGTTTACATTATGG -3′，下游引物：5′-AAACACAAACTTGAACAGCTAC-3′。以GAPDH作為內參對照。引物反應體系為20 μL（包括上下游特異性PCR引物各0.8 μL、TaKaRa Ex Taq HS 1.2 μL、PrimeScript RTaseMix 0.4 μL、滅菌超純水4.8 μL、One Step TB Green RT-PCR Buffer 10 μL、total RNA 2 μL）。逆轉錄反應條件：42℃5 min，95 ℃10sec，20℃/sec，進入PCR循環，循環參數為95 ℃5sec，60℃ 20sec，20℃/sec循環40次。采用2-△△Ct法計算E1/CCAT1、C-MYC相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件。計數資料以［n（%）］表示，多組間比較采用卡方檢驗。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析。組織E1/CCAT1相對表達水平與C-MYC的相關性采用Pearson相關分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV18陽性的HeLa 細胞中E1/CCAT1融合轉錄本表達 HeLa細胞株中可檢出4個融合轉錄本，包括E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，231，211）、E1/CASC19（E1_1489084/Chrom8_128，215，465）、E1/intergenic（E1_1489084/Chrom8_128，241，488）、E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，221，962）。其中，融合轉錄本E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，231，211）的檢出豐度明顯高于其他融合轉錄本。E1/CCAT1融合轉錄本，宿主基因為CCAT1，整合位點位于8號染色上的128，231，211；HPV病毒基因E1，整合位點位于E1上的929。以下黑色加粗部分為插入的HPV E1基因序列：TTTCAGAAAGAGCGTCAGGGTTGACAG TAGCTGTGATGCTCCAGATGGAGCTGCGGATAACAGC ATATAAGTTTCAGGGCAGTGGTTGAGGGGCTGTGGGA GGGTGGGGAGGGAAGATGGATGACTTTTCTCAACCAT CTGTATTTGATTGGAATATTGTGTGACTTGTGAAATAG AATTAAAGATATGATCTTCTTATGGTCTTCTCACAGTT TTCAAGGGATTTTAGGAGAAAACGCTTAGCCATACAG AGCTTCTGGATCAGCCATTGTTGCTTCTGCTGGGATGA AACTTCAAAGTCGATGTTGTCAGTGAATGCTCCAGAT GGATTGCAGAGAAGACCAAAGTTCATGTCTCGGCACC TTTCGCAT。

2.2 E1/CCAT1在宮頸病變組織和脫落細胞中的表達情況 在62例HPV18感染患者的宮頸組織中共檢測出17例E1/CCAT1的表達，CIN1陽性表達率為23.8%（5/21），CINⅡ/Ⅲ為25.0%（7/28），宮頸癌38.5%（5/13），相對于宮頸脫落上皮細胞9.5%（10/105）的陽性表達率，顯示出較高的融合比例。三組組織標本的陽性表達率比較，差異無統計學意義（χ2=1.016，P＞0.05），見表2。但是，相對表達水平隨著宮頸癌病變程度加重，呈現逐級升高趨勢，見圖2a。

表2 不同來源的HPV18感染標本E1/CCAT1表達情況

2.3 E1/CCAT1與C-MYC表達的相關性分析 通過檢測上述組織標本中C-MYC，其相對表達水平亦隨著宮頸病變程度呈現上升趨勢，見圖2b。通過對宮頸病變組織中E1/CCAT1和C-MYC的表達水平進行Person相關性分析，發現兩組之間呈正線性相關（r=0.918，P＜0.001），見圖2c。

圖2 E1/CCAT1和C-MYC的相對表達量及相關性分析

3 討論

高危型HPV感染是發生宮頸癌的主要風險因素［10］，WHO推薦高危HPV檢測用于宮頸癌初篩，HRHPV陽性者再行陰道鏡檢查［11-12］。成年女性幾乎均會發生HPV感染，雖然95%以上的宮頸癌均可檢測到HPV病毒的癌蛋白表達，但僅有極少數高危型HPV感染最終會發展成為宮頸癌。深入探索HPV的致病機制及其與宮頸癌的內在關聯，尋找可以精確反映宮頸癌發生及預后的標記物，開發高效、簡便的宮頸癌癌前病變診斷新技術，具有重要的社會及經濟意義。研究發現，HPV與宿主基因組的整合是宮頸細胞永生化過程中的“one-shot”機制［13］。HPV 感染宿主細胞后通常以游離狀態存在，首先潛伏在基底細胞層，其DNA以獨立的外源性染色體狀態游離于被感染細胞核內，繼之HPV核酸整合至宿主細胞內，表達病毒癌基因的同時導致宿主細胞相關基因表達發生變化，并逐漸發展為宮頸癌。

E1是解旋酶，也是HPV編碼的唯一酶［14］。HeLa細胞中沉默的HPV18 E1上調了參與宿主免疫反應和細胞周期調控的基因，表明E1在致癌作用中具有一定作用［15］。E1還可以誘導DNA損傷，抑制細胞生長并募集宿主細胞來增加病毒復制［16］。壓力作用下，E1以低保真度復制HPV DNA，并產生雙鏈斷裂，可能是致癌因素的驅動因素［17］。研究發現，人類8號染色體的結腸癌相關轉錄因子1（colon cancer associated transcript 1，CCAT1）基因座與HPV18病毒的E1_1489084基因融合產生的融合轉錄本E1/CCAT1，C-MYC基因是位于染色體8q34上的一個癌基因，位于CCAT1基因座下游，作為轉錄因子受CCAT1調控。CCAT1是一個2628 nt 的非編碼長鏈RNA（long noncoding RNA，lncRNA），位于染色體8q24.21，與多種生物學過程如染色體沉默、染色質修飾、轉錄激活劑干擾有關，與腫瘤的發生發展、浸潤、轉移密切相關，是重要的致癌基因［18-19］。CCAT1位于轉錄因子C-MYC 附近，可與C-MYC相互作用進而影響細胞的生物學特性［20-21］。MYC是重要的原癌基因，C-MYC在細胞周期中起重要調控作用，影響細胞增殖、分化和凋亡，其表達水平與癌細胞增殖程度有關［22］。C-MYC的異常激活具有促進細胞分裂和增殖的作用，從而參與宮頸癌的發生發展過程［23］。本研究結果顯示，E1/CCAT1的表達水平隨著宮頸病變程度的加重而呈升高趨勢，且E1/CCAT1同C-MYC的表達高度正相關，表明HPV整合會影響臨近的基因，最常受影響的基因就是MYC基因。CCAT1位于MYC基因上游可增強C-MYC的表達，過表達的CCAT1不僅具備其內源分子的特性，還使得MYC基因表達上調，并明顯促進了腫瘤生長。陳玲玲等［24］發現，順式過表達的CCAT1不僅具備其內源分子的特性，還可上調MYC基因表達，明顯促進腫瘤生長，表明CCAT1可以調控其下游相近的MYC基因表達，在腫瘤發生中起著一定作用。

本文在宮頸上皮細胞中共驗證105例，陽性10例，陽性率約為9.5%。結果表明，并不是所有HPV18感染的患者都存在HPV-host整合，可能只有約10%的患者有必要再行陰道鏡檢查。陽性結果的出現表明，融合轉錄本在宮頸病變過程中具有一定作用，而陽性率的升高更加表明HPV18整合產生的融合轉錄本與宮頸病變密切相關。因為僅有少數高危HPV感染最終發展成為宮頸癌，所以采用與宮頸細胞癌變密切相關的融合轉錄本作為宮頸癌初篩指標可能優于單純采用高危型HPV感染作為后繼陰道鏡檢查的指針。HPV整合宿主基因形成融合轉錄本可能成為宮頸癌篩查的新指標，E1/CCAT1融合轉錄本具備成為反映宮頸癌病變標志物的潛能。由于融合轉錄本檢測能夠縮小宮頸癌目標人群范圍，還可以避免過度醫療造成的醫療資源浪費，降低醫保資金的支出。

綜上所述，高危HPV與宿主染色體的整合是宮頸癌癌前病變向宮頸癌進展的關鍵步驟，HPV整合位點附近宿主基因組的表達變化及整合后病毒癌基因的表達增強可能是宮頸癌發病的重要導火索。本研究所測得的融合轉錄本極有可能是通過調控CCAT1基因組的表達而發揮其在宮頸癌病變中的作用，具體機制有待進一步研究。